多囊卵巢綜合征患者子宮內膜組織中同源框基因 A10蛋白的表達

管一春,楊雪峰,王興玲,孫麗君,王雪梅,婁 華,李巍巍

1)鄭州大學第三附屬醫院生殖中心鄭州 450052 2)鄭州大學第三附屬醫院婦產科鄭州 450052△女,1977年5月生,碩士,主治醫師,研究方向:生殖內分泌,E-mail:lisamayguan@126.com

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是育齡婦女常見的內分泌紊亂性疾病,是無排卵性不孕的主要原因。臨床中發現,經促排卵治療, PCOS患者的排卵缺陷糾正后,妊娠率仍低,流產率則很高。研究[1]認為PCOS患者機體內分泌和代謝的異常可導致子宮內膜容受性下降,子宮內膜發育和內膜對胚泡容受性失調可成為生育能力低下和不良生殖結局的原因之一。同源框基因(homeobox gene,HOX)A10作為一種多效性轉錄因子參與胚胎種植的各個環節,如子宮內膜的增殖與分化、子宮內膜容受性的建立和胚胎的定位與黏附等環節,它是胚胎著床和成功妊娠所必需的[2]。作者采用免疫組化SP法檢測PCOS患者不同組織分期子宮內膜HOXA10蛋白的表達情況,探索PCOS子宮容受性異常的原因,為臨床研究提供新思路和依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集 2008年 10月至 2009年 10月在鄭州大學第三附屬醫院生殖中心就診的已婚PCOS患者20例,年齡23～33(28.5±3.3)歲。PCOS診斷依據 2003年鹿特丹標準[3]。同期就診的已婚不孕癥(不孕原因為男方因素或輸卵管梗阻,擬行體外受精-胚胎移植治療)患者26例作對照,年齡25～40(28.7±4.1)歲。月經周期性激素水平和盆腔超聲檢查均正常。研究對象對該研究均知情同意,且排除其他內分泌疾病,3個月內無激素類藥物應用史,無心、肝和腎疾病史。

1.2 標本采集 所有患者均于月經周期的5～14 d和自然周期或使用氯米芬/人絕經期促性腺激素/人絨毛膜促性腺激素方案促排卵周期的著床窗口期(陰道超聲監測確認排卵后 7～8 d,血總絨毛膜促性腺激素T-HCG證實未孕)無菌操作下使用Pipelle管吸刮子宮前后壁,采集子宮內膜組織標本。根據Noyes標準判定組織學分期:PCOS增生期13例,分泌中期 7例;對照增生期 16例,分泌中期 10例。

1.3 子宮內膜病理組織學檢查 將子宮內膜組織標本迅速置于體積分數 10%多聚甲醛中固定,常規脫水,梯度乙醇脫水后石蠟包埋,行HE染色。鏡下觀察其間質反應不良和內膜分泌反應欠佳發生情況。

1.4 子宮內膜組織HOXA10蛋白的表達 采用免疫組織化學SP法。組織切片脫蠟,抗原熱修復后加入一抗HOXA10(羊抗人多克隆抗體,工作濃度為1∶50,美國Santa Cruz公司),4℃過夜,滴加生物素標記的二抗(羊抗鼠,北京中杉金橋生物技術有限公司),DAB顯色,蘇木素復染,封片。試劑公司提供的已知陽性片作為陽性對照,PBS代替一抗作為陰性對照。以細胞核出現棕黃色顆粒者為染色陽性細胞。每張切片隨機選取不重疊的 5個高倍鏡視野(×400),使用Powersite顯微圖像采集分析系統分別測量 HOXA10陽性區的灰度值,結果取平均值。

1.5 統計學處理 采用SPSS 11.0分析。各組子宮內膜組織中HOXA10蛋白表達的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗;PCOS和對照增生期組間質反應不良發生率以及PCOS和對照分泌中期組內膜分泌反應欠佳發生率比較采用確切概率法,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組患者子宮內膜病理組織學觀察 見圖1。PCOS患者間質反應不良發生率為50.0%(10/20),高于對照患者的15.4%(4/26)(P=0.022)。PCOS分泌中期組子宮內膜分泌反應欠佳發生率為85.7% (6/7),高于對照分泌中期組的10.0%(1/10)(P= 0.004)。

2.2 各組患者子宮內膜組織中HOXA 10的表達HOXA10主要表達于子宮內膜間質細胞。見圖2和表1。

表1 各組子宮內膜組織HOXA 10蛋白的表達

3 討論

PCOS患者體內異常的內分泌環境對子宮內膜形態和功能有一定的不良影響[4]。PCOS患者自然月經周期絕大部分均為無排卵周期,作者采用促排卵方案來獲取其分泌中期的子宮內膜。研究結果顯示,50%的PCOS患者子宮內膜表現間質反應不良,間質呈現局灶性致密,提示PCOS患者的子宮內膜對性激素的反應性下降,缺乏隨激素水平變化的能力,影響蛻膜化,進而影響著床。其分泌中期的子宮內膜中,分泌反應欠佳發生率高達 85.7%,則提示PCOS患者應用促排卵治療后,可正常排卵,但黃體功能較差,與報道[5]一致。

同源框基因屬于多基因家族的轉錄調節基因,通過和DNA結合激活或抑制目標基因的表達。研究[6]發現,野生的小鼠胚胎不能在HOXA 10基因缺失的小鼠子宮內著床。當轉染持續表達 HOXA 10的質粒時,可提高移植胚胎的著床率[7]。小鼠胚胎著床前轉染HOXA 10抑制劑可降低其在子宮內膜的表達,并觀察到胞飲突數量顯著減少;而胞飲突形成前強化HOXA10的表達則其數量增加,HOXA 10基因可調控胞飲突的發育[8]。以上研究均提示, HOXA10基因的持續表達是胚胎著床所必需的。

李紅等[9]認為 HOXA10在增生期子宮內膜低表達,分泌中期至晚期子宮內膜則高表達,且間質表達明顯高于腺體。作者發現,HOXA10在正常增生期和分泌中期子宮內膜均表達,定位于間質細胞的胞核,未見腺上皮細胞的表達。研究[10]表明,不明原因不孕、輸卵管積水等各種類型不孕患者,其分泌中期子宮內膜HOXA10表達較正常對照組顯著下降。該研究結果顯示,HOXA10在PCOS患者增生期和分泌中期子宮內膜間質細胞的胞核中均表達,呈現周期性變化,而在分期相同的子宮內膜,PCOS患者HOXA10的表達水平顯著低于其對照組。

HOXA10可通過誘導其下游基因的激活或抑制而發揮作用。而研究[11]發現,PCOS患者內膜整合素 β3表達也下降。整合素 β3是目前公認的內膜容受性標志物之一[12],而 HOXA 10作為其上游基因,在植入的各過程中發揮作用,影響內膜容受性。該研究結果顯示,PCOS患者增生期和促排卵治療后分泌中期的子宮內膜,其HOXA10的表達低于正常對照。提示PCOS患者固有的低雌激素狀態、促排卵治療后的黃體期孕酮分泌減少,均可影響其內膜HOXA10的表達,進而影響其內膜容受性。PCOS患者過高的雄激素也可對抗雌激素和孕酮與相應受體的結合影響內膜HOXA 10的表達,此外雄激素可增加雄激素受體(androgen receptor,AR)的表達[13],過多的AR可直接作用內膜,使PCOS患者HOXA10表達下降,從而影響了其下游的內膜容受性相關的分子途徑,導致PCOS患者妊娠率低和流產率高。

總之,HOXA10在PCOS患者子宮內膜的低表達可能參與了其內膜容受性下降的發生、發展過程。因此,未來可通過定向子宮內膜基因治療,如在著床期調控性激素濃度,上調PCOS患者內膜HOXA10的表達,改善其內膜容受性,提高PCOS的胚胎著床率和妊娠率,降低流產率。

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