河南漢族人群DYS713和DYS720基因位點遺傳多態(tài)性檢測

張俊杰,宋麗君,劉建新,陳 輝,李曉文#

1)鄭州大學基礎醫(yī)學院細胞生物學與醫(yī)學遺傳學教研室鄭州 450001 2)深圳建安醫(yī)藥有限公司深圳 518027 #通訊作者,女,1955年8月生,教授,研究方向:遺傳病的分子機制與基因診斷,E-mail:lixiaowen@zzu.edu.cn

Y染色體短串聯(lián)重復序列(Y-short tandem repeat,Y-STR)呈精確的父系單倍體連鎖遺傳,具有多態(tài)性信息含量高、擴增片段小、檢測靈敏度高、分型簡便及宜于推廣應用等特點,在進行父系親權鑒定等特殊案例中具有常染色體 STR無法比擬的優(yōu)點。目前 Y-STR的研究[1-4]熱點集中于單倍型多樣性,尋求新的高多態(tài)性Y-STR基因位點構建單倍型是提高單倍型多樣性的關鍵。此外,由于Y-STR基因位點具有明顯的民族和地域差異,因此任何新位點在構建單倍型進行實際應用前都應首先研究其在該群體或種族中的基因多樣性[5]。作者調(diào)查了DYS713和DYS720基因位點在河南漢族群體中的遺傳學數(shù)據(jù),以期為單倍型的構建提供高多態(tài)性的Y-STR基因位點,為法醫(yī)物證學鑒定提供參考數(shù)據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇 203名河南漢族無親緣關系體檢健康的男性個體,抽取外周靜脈血液2mL,EDTA抗凝。所有研究對象對該研究均知情同意。

1.2 DYS713和DYS720基因位點的PCR鑒別常規(guī)苯酚-氯仿抽提法提取外周血基因組 DNA。2個Y-STR基因位點的引物序列均來源于STRBase (http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase),由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。DYS713上游引物序列5'-GTGCAAGCCAAGGGCTTTATAAGT-3',下游引物序列5'-CCTGGGTGACAGACTC CATCTTAAA-3';DYS720上游引物序列 5'-AGAGAGAGAGGGAGAGAGAACG-3',下游引物序列5'-TCTGGTGTG TGAAGGACAGC-3'。PCR反應體系:Mix 10μL,DNA 1.7μL,引物終濃度1μmol/ L,ddH2O補充至 20μL。擴增條件:96℃預變性2 min;94℃變性1 min,60℃退火1 min,70℃延伸1.5min,10個循環(huán);90℃1min,60℃1 min,70℃1.5min,20個循環(huán);60℃延伸30min后4℃保存。取10μL擴增產(chǎn)物,在80 g/L變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳,銀染顯帶。

1.3 等位基因分型標準品的制備及結(jié)果判定[6-7]

自制等位基因分型標準品并經(jīng) DNA測序確定其堿基序列,按國際法醫(yī)遺傳學學會DNA委員會(ISFG DAN Commission)推薦的命名原則進行命名。根據(jù)分型標準品梯階對照命名待檢等位基因。等位基因頻率(P)采用直接計數(shù)法:Pi=n/N;基因多樣性(gene diversity,GD)=n(1-∑Pi2)/(n-1);個體識別力(discriminating power,DP)=1-∑Pi2;其中, n為等位基因個數(shù),N為樣本數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 10.0進行分析,應用χ2檢驗比較河南、河北男性人群中 2個基因位點的差異,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DYS713和DYS720基因位點檢測結(jié)果 見表1。DYS713基因位點擴增條帶312～340 bp,共檢出 8個等位基因,根據(jù)其核心重復單位的拷貝次數(shù)的不同分別命名為等位基因 28～35(圖 1); DYS720基因位點擴增條帶219～255 bp,共檢出 10個等位基因,分別命名為等位基因 27～36(圖 2)。

表1 DYS713和DYS720基因位點多態(tài)性檢測結(jié)果(n=203)

2.2 河南、河北[5]人群DYS713和DYS720位點的比對分析 見表2。

表2 河南、河北人群DYS713、DYS720位點的比較

3 討論

Y-STR由2～6個核苷酸組成的核心單元不斷重復排列構成,多態(tài)性信息含量高。目前常染色體STR在法醫(yī)學和遺傳學等親權鑒定中廣泛應用,但在父系男性成員間進行親權鑒定及主要為女性成分的混合斑鑒定等特殊案例中,Y-STR是常染色體STR檢測的重要輔助參考。另外,Y-STR基因位點無雜合態(tài),可以用于男性混合樣本或男女混合樣本遺傳標記的區(qū)分[3,8-9]。20世紀初期,各實驗室大多采用MHL進行單基因座擴增實驗研究,為進一步提高Y-STR在實際工作中的鑒別能力,各實驗室對其進行擴展,加入其他新的高多態(tài)性Y-STR基因位點,并構建不同的復合擴增體系進行單倍型多態(tài)性研究。雖然增加Y-STR基因位點的檢測數(shù)目可提高其單倍型多態(tài)性,但在實際應用中,并非檢測的基因位點數(shù)目越多,單倍型多樣性和個體識別能力就越高,單倍型多樣性的高低與構成單倍型的各個基因位點的基因多態(tài)性密切相關。因此,選擇多態(tài)性高的基因位點構建單倍型,是增加單倍型多樣性和提高其應用價值的關鍵[10-15]。

作者的實驗結(jié)果顯示,DYS713和DYS720基因位點的基因多樣性分別為 0.729 8和 0.777 8,且這2個基因位點的擴增片段小(200～350 bp),等位基因數(shù)目相對較多,分別為 8和 10個,擴增條帶清晰且易于區(qū)分,檢出靈敏度高,具有高度的種屬特異性和較低的突變率。因此,DYS713和DYS720基因位點在河南地區(qū)個體識別和親權鑒定等檢測實驗當中均具有較高的應用價值。由目前可查閱的文獻可知,這 2個基因位點在國內(nèi)外的研究應用極少,可用來對比參考的數(shù)據(jù)也很少,因此,這 2個基因位點的民族及地域性差異還有待進一步深入研究。

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