DPC4基因轉染對胰腺癌JF305細胞凋亡的影響

邵麗春,郭曉鐘,徐建華,鄧國偉

1)解放軍第 463醫院消化內科沈陽 110042 2)沈陽軍區總醫院消化內科沈陽 110016 3)沈陽軍區空軍門診部內科沈陽110015

△女,1970年2月生,碩士,副主任醫師,研究方向:消化系統疾病

胰腺癌是臨床常見的惡性腫瘤,以轉移早、預后差為特征,5 a生存率低。DPC4為新的腫瘤抑制基因,在 50%胰腺癌中存在失活[1]。研究[2]發現DPC4基因參與細胞凋亡過程。Bcl-2和Bax是Bcl家族的成員,在凋亡過程中發揮重要作用[3]。Bcl-2可抑制細胞凋亡,延長細胞生存周期,增加細胞對多種凋亡刺激的抗性,但并不刺激細胞增生。Bax是凋亡促進基因,能夠拮抗 Bcl-2抑制凋亡。作者通過脂質體介導法將pBK-CMV-DPC4質粒導入人胰腺癌細胞系JF305中,觀察轉染DPC4基因后JF305細胞的凋亡情況以及生長、增殖等生物學行為的改變,初步探討DPC4基因促進細胞凋亡與抑制腫瘤細胞生長的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 ①細胞:JF305細胞由中國醫科大學腫瘤研究所惠贈。②質粒:重組質粒pBK-CMV-DPC4和空白質粒pBK-CMV均由德國Hahn教授惠贈;質粒經大連寶生物公司測序后證實含DPC4 cDNA的完整全長序列,無突變及插入等改變。③主要試劑及儀器:二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司,胎牛血清購自美國Hyclone公司。鼠抗人DPC4單克隆抗體購自上海生工生物工程有限公司,熒光標記二抗、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體及鼠抗人Bax單克隆抗體及試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。BCA Protein Assay試劑盒購自美國Pierce公司。Facsort流式細胞儀購自美國BD公司。3550型酶聯檢測儀購自美國Bio-Rad公司。Lipofectamine2000購自LIFE Technologies公司。

1.2 實驗分組 JF305貼壁細胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化,臺盼藍染色計數活細胞。用脂質體轉染法將pBK-CMV-DPC4和空質粒pBK-CMV分別轉染JF305細胞,轉染細胞經400mg/L的G418培養5～6周,篩選出抗 G418的細胞擴大培養。收集未轉染、轉染pBK-CMV-DPC4和轉染pBK-CMV的細胞進行指標測定。

1.3 觀測指標

1.3.1 流式細胞儀法檢測Bcl-2及Bax蛋白的表達 分別收集 3種細胞,用含體積分數 5%胎牛血清的PBS液清洗并調整細胞濃度為2×107mL-1。取0.1mL置于流式管中標記,另取一管作空白對照。加入鼠抗人Bcl-2、Bax單克隆抗體(1∶50稀釋)混勻,4℃過夜。加入熒光標記的二抗 3μL,避光,室溫孵育30min,上流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.3.2 Western blot法檢測DPC4蛋白的表達 分別收集 3種細胞,用 PBS清洗 2次,加入細胞裂解液,混勻,用刮匙刮取,移入1.5m L EP管中,置于冰上15 min,于低溫離心機中13 000 r/min離心10 min,取上清,-20℃凍存。用BCA Protein Assay試劑盒測定樣本上清液中蛋白濃度,然后進行垂直平板電泳。分離膠80 g/L,濃縮膠40 g/L。電泳后,將凝膠、濾紙及硝酸纖維素膜浸入轉移緩沖液中平衡30min,之后利用Mini-ProteinⅡ型電轉槽進行轉印,100 V恒壓轉印80min。轉印結束后,取下硝酸纖維素膜用含40 g/L脫脂奶粉的Tween20-PBS溶液室溫封閉1.5 h。滴加1∶200鼠抗人DPC4單克隆抗體,室溫下振蕩孵育1 h。顯影拍照。用Graph-Pad PRISM軟件掃描分析圖像,計量陽性條帶的灰度值。

1.3.3 MTT法檢測細胞增殖率 取處于對數生長期的 3種細胞,常規消化配置成單細胞懸液。以1× 103/孔接種于 96孔板中,每種細胞設 24孔,以培養液為空白對照,重復 5塊板。常規CO2孵箱中培養48 h后取出其中一塊板,每孔加入5 g/L的MTT 20 μL,繼續培養4 h,每孔加入150μL DMSO,振蕩10 min使MTT充分溶解。用酶聯免疫檢測儀測定各孔在490 nm的吸光度(A)值,計算細胞增殖率,增殖率=(實驗組A值/對照組A值)×100%。以后每24 h取一塊板按上述步驟進行測定,每組測定5次。

1.3.4 細胞周期測定 采用流式細胞術檢測細胞周期。將 3種細胞制成單細胞懸液 1×106mL-1,上機測定細胞周期。重復 3次。

1.4 統計學處理 采用SPSS 17.0進行統計學處理。3組細胞DPC4、Bcl-2及Bax蛋白表達水平, Bcl-2/Bax比值,細胞增殖率和細胞周期的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3種細胞DPC4、Bcl-2及Bax蛋白的表達 見表1。

表1 3種細胞DPC 4、Bcl-2及Bax蛋白測定結果(n=3)

2.2 3種細胞增殖率和細胞周期測定結果 見表2、3。

表2 3種細胞增殖率檢測結果(n=5)

表3 3種細胞細胞周期檢測結果(n=3) %

3 討論

以往的研究[5]表明 DPC4對胰腺癌細胞株、乳癌細胞株有明顯的促凋亡作用。Dai等[5]將野生型DPC4基因導入人乳癌細胞后,細胞出現 G1期停滯和凋亡,進一步研究發現Smad4核移位直接誘導了細胞凋亡,其誘導凋亡作用不依賴 P53和 RB蛋白[5]。袁晟光等[2]將 DPC4基因導入胰腺癌細胞株HS766中,細胞亦發生凋亡,同時發現 DPC4基因只有在TGF-B信號傳遞系統的其他成員共同作用下才能誘導細胞凋亡。Ke等[6]證實DPC4基因參與了小細胞肺癌的發生,并通過調節凋亡基因Bcl-/ Bax之間的平衡誘導細胞凋亡。

作者將DPC4基因成功轉染入JF305細胞,觀察DPC4、Bax及Bcl-2蛋白的表達,并觀察轉染后細胞周期和細胞增殖力的變化。結果顯示,胰腺癌JF305細胞株轉染DPC4基因后,細胞生長緩慢,細胞周期停滯在G1期,轉染后JF305細胞中Bcl-2的表達明顯下降,Bax蛋白的表達明顯增強,Bcl-2/Bax比值下降,表明轉染DPC4的JF305細胞凋亡作用增強。由此推測DPC4通過調整抑制凋亡基因bcl-2和促凋亡基因bax的表達,誘導細胞凋亡,從而抑制了腫瘤的生長,但具體機制需進一步實驗證實。

[1]Zawel L,Dai JL,Buckhaults P,et al.Human Smad3 and Smad4 are sequence-specific transcription activators[J]. Mol Cell,1998,1(4):611

[2]袁晟光,馮燮林,田聆,等.Smad4對胰腺癌細胞HS766T生長抑制的研究[J].第三軍醫大學學報,2003,25(9): 795

[3]王舉,竇忠霞,韓喜春,等.大腸癌及癌旁組織中抑凋亡基因bcl-2和促凋亡基因bax的表達及意義[J].中國普外基礎與臨床雜志,2002,9(4):252

[4]劉一平,邱兆華,張映輝,等.SMAD 4蛋白對胰腺癌細胞促凋亡作用的研究[J].生物技術通訊,2000,11(3):85

[5]Dai JL,Bansal RK,Kern SE.G1 cell cycle arrest and apoptosis induction by nuclear Smad4/DPC4:phenotypes reversed by a tumorigenic mutation[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(4):1427

[6]Ke Z,Zhang X,Ma L,et al.Deleted in pancreatic carcinoma locus4/Smad 4 participates in the regulation of apoptosis by affecting the Bcl-2/Bax banlance in non-small cell lung cancer[J].Hum Pathol,2008,39(10):1438