熒光原位雜交技術在膀胱癌診斷中的應用*

陳瑞廷,楊錦建,賈占奎,胡寶利

鄭州大學第一附屬醫院泌尿外科鄭州 450052

#通訊作者,男,1962年 2月生,博士,主任醫師,研究方向:泌尿外科疾病的基礎與臨床,E-mail:yangjinjian66@ 126.com

膀胱腫瘤是泌尿系統最常見的腫瘤。膀胱癌主要依靠膀胱鏡檢查并取活組織檢查確診,但膀胱鏡檢查為有創檢查,且與膀胱炎癥不易區別。熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是一種分子細胞遺傳學技術,近年來廣泛應用于基因定位、染色體進化和遺傳毒理學等基礎研究。作者以膀胱鏡活檢結果為金標準,采用FISH技術檢測尿脫落細胞用以診斷膀胱癌,并與尿脫落細胞學檢查結果相比較,評價其對膀胱癌的診斷價值,同時分析不同分期、不同分化程度膀胱癌的染色體畸變情況。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2009年 7月至 2010年10月因肉眼血尿癥狀在鄭州大學第一附屬醫院泌尿外科住院的患者 100例,排除泌尿系結石、尿道息肉及上尿路腫瘤病變,其中男 62例,女 38例,年齡 31～82 (57.9±15.6)歲。膀胱鏡活檢確診為膀胱移行細胞癌 75例,腺性膀胱炎病變 25例。75例膀胱癌患者中,術后病理分期:Tis期7例,Ta期24例,T1期20例,T2期 14例,T3期 8例,T4期 2例;高分化 48例,低分化 27例;65例行經尿道膀胱腫瘤電切術, 10例行膀胱全切術。

1.2 標本采集 患者均在膀胱鏡檢查前行尿脫落細胞FISH檢測和細胞學檢查。留取250 mL以上的新鮮晨尿,1 h內送檢。每例尿樣分為 2份,分別行尿脫落細胞學檢查和FISH檢測。容器為一次性使用,清潔、干燥,開口大,有明顯標記,尿液要防止異物混入。

1.3 FISH檢測 應用北京金菩嘉公司提供的染色體探針試劑盒,包括CSP3/CSP7和GLP P16/CSP17兩組探針。實驗步驟:取200 mL以上晨尿離心去上清,依次加入膠原酶B、KCl低滲溶液及固定液處理后,制備細胞滴片 2張,烤片機老化。將玻片放入37℃HCl與胃蛋白酶混合液中孵育10 min。2× SSC溶液漂洗玻片 2次,甲醛固定,梯度乙醇脫水,自然干燥。室溫避光,取7μL雜交緩沖液、1μL去離子水和 2μL染色體著絲粒探針混合物滴于玻片雜交區域,立即加蓋玻片,橡皮膠封邊,78℃雜交儀變性5min。玻片置于濕盒中42℃過夜雜交,洗滌、復染后于熒光顯微鏡下分析觀察,攝片保存。GLP P16和CSP7探針為紅色信號,CSP17和CSP3探針為綠色信號。按金菩嘉公司提供的正常閾值標準進行陽性結果判定。4個探針至少 2種探針信號異常判定為陽性。

1.4 尿脫落細胞學檢查 取約50mL的新鮮尿液離心,取沉淀制成細胞涂片,常規 HE染色后鏡下觀察。每例患者連續檢測 3 d,發現 1次癌細胞即判為陽性。

1.5 統計學處理 應用SPSS 10.0進行數據處理,計算尿脫落細胞學和FISH檢查的靈敏度、特異度和約登指數,評價其診斷價值;采用配對 χ2檢驗對不同分化程度和不同分期的膀胱癌患者的兩種檢測結果進行比較;采用 χ2檢驗對不同分化程度和不同分期膀胱癌患者FISH各探針陽性率進行比較,檢驗水準α=0.05。

2 結果

FISH陽性表現見圖 1。以 4種探針聯合的FISH檢測和尿脫落細胞學檢查的靈敏度、特異度和約登指數計算結果見表 1,不同分化程度和不同分期膀胱癌患者 2種檢查結果的比較見表 2,不同分化程度、不同分期膀胱癌患者FISH各探針檢測結果的比較見表 3。

圖1 腫瘤細胞的FISH陽性表現

表1 2種檢測方法的靈敏度、特異度和約登指數比較

表2 2種檢查結果的比較 例(%)

表3 FISH檢測結果分析 陽性例數(%)

3 討論

FISH是在原有的放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性原位雜交技術,近年來泌尿外科工作者將其應用于膀胱癌的診斷和復發監測。Marin-Aguilera等[1]的研究結果顯示FISH用于診斷淺表性膀胱癌的靈敏度高于尿脫落細胞學檢查;而兩者的診斷特異度差異無統計學意義。國內相關文獻[2-3]也報道 FISH檢測比尿脫落細胞學具有更高的靈敏度,但兩者的特異度相似。Constantinou等[4]研究發現膀胱癌 T1期患者FISH檢測陽性率為80%,T2、T3期患者的陽性率為 100%。該研究結果顯示:FISH檢測診斷膀胱癌的總靈敏度為0.827,明顯高于尿脫落細胞學檢查的 0.387;而兩者特異度相似;此外,FISH檢測的約登指數較高,提示其真實性強,對于高分化或Tis、Ta及T1期膀胱癌,FISH的陽性率亦顯著高于尿脫落細胞學,提示FISH檢測在診斷低級別及低分期膀胱癌時比尿脫落細胞學具有優勢。

CSP3、CSP7、GLP P16及CSP17探針分別用于脫落細胞的3、7、9p21(p16)和17號染色體數目畸變的檢測。Veeramachaneni等[5]進行的FISH研究發現膀胱癌 3號染色體多倍體高達 76%。在對非浸潤性膀胱癌病理切片的FISH研究中,Krǜger等[6]發現 3號染色體多倍體占 27%,7號染色體多倍體占13.0%～76.2%,17號染色體多倍體僅占12%,9p21的純合性缺失率為28.6%～83.0%。多項研究[7-9]表明 3號染色體中的基因過表達與膀胱癌的病理分級相關,7號染色體多倍體與病理分期、分化程度相關,17號染色體的異?？赡艽龠M了膀胱癌的發生和進展。另有研究[10-11]認為 9p21缺失是膀胱癌早期最常見的改變之一,其可能作為膀胱癌早期診斷和監測復發的重要分子標志。但多數研究[11-13]認為 9號染色體的畸變與分期、分化程度無關,但在低分化、低分期癌中常見。該研究發現,膀胱癌中CSP3、CSP7、GLP P16和CSP17探針的陽性率分別為57.3%、57.3%、70.7%和54.7%;3號和7號染色體異常與膀胱癌病理分期有關,隨著病理分期的升高,CSP3、CSP7探針陽性率增加,但與分化程度無關;而 9號和 17號染色體異常與病理分化程度有關,隨著腫瘤細胞惡性程度的增高,GLP P16、CSP17陽性率增加,但與病理分期無關。該研究亦發現在Tis期膀胱癌中P16異常達5/7,提示9p21異常可能在膀胱癌的早期診斷中起重要作用。

總之,FISH技術作為診斷和監測膀胱癌的一種簡單、無創性診斷方法,具有較高的靈敏度和特異度,其對提高人群膀胱癌的早期診斷率具有重要的臨床應用價值。

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