血管內皮抑素聯合肝動脈化療栓塞對大鼠肝癌移植瘤組織血管生成的影響*

張寶南,魏治鵬

無錫市中醫醫院腫瘤科無錫 214001

原發性肝癌是我國常見的惡性腫瘤,肝動脈化療栓塞術(TACE)是常見的中晚期肝癌的重要治療手段,但TACE很難達到手術治療效果,復發和轉移是影響長期療效的主要原因[1]。患者TACE后檢測的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平往往升高,提示腫瘤周圍血管形成和側支循環建立[2],因此抗腫瘤血管生成治療有可能改善TACE的療效。血管內皮抑素是抗血管生成代表藥物,能特異性作用于新生血管內皮細胞,對抗VEGF的促血管生成而發揮作用[3-4]。作者建立雄性成年Wistar大鼠肝癌移植瘤模型,采用重組人血管內皮抑素(rh-Endostatin,YH-16)聯合TACE進行治療,觀察腫瘤組織內VEGF的表達和微血管密度(microvessel density,MVD),了解YH-16在抗腫瘤血管生成中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與動物 40只雄性成年Wistar大鼠(體質量180～250 g)和5只傳種Wistar幼鼠均購自上海中國科學院細胞所動物房。Walker-256瘤株購自上海醫藥工業研究院。鼠抗人VEGF免疫組化試劑盒購自美國Lab Vision公司(上海晶美生物工程有限公司代理),兔抗人CD34單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。阿霉素購自深圳萬樂藥業有限公司,超液化碘油購于法國Cuerbet公司。YH-16由江蘇先聲藥業有限公司提供,15 mg(3 mL/支),4℃冰箱貯藏,避免劇烈振蕩。

1.2 栓塞劑配制 阿霉素碘化油乳劑制備:取阿霉素50 mg+超液化碘油10 mL充分乳化;YH-16-阿霉素碘化油乳劑制備:取YH-16 30 mg混入阿霉素碘化油乳劑中充分乳化。

1.3 大鼠肝癌移植瘤模型的建立 無菌條件下,將瘤株從液氮中復蘇并增殖至4×106m L-1,注入傳種大鼠腹腔,1周后大鼠出現癌性腹水,抽出癌性腹水0.5～1.0mL注入另一只大鼠皮下,1周后皮下長出1 cm3大小實體瘤,將荷瘤大鼠處死,無菌條件下取出實體瘤,局部消毒,去除纖維組織,挑選無出血、壞死腫瘤組織,切成2mm×2 mm×2 mm備用。另取大鼠40只,以戊巴比妥鈉按40 mg/kg腹腔注射麻醉,大鼠取仰臥位,四肢固定于手術板上后,術區用體積分數為75%乙醇消毒,腹正中切開皮膚1.0 cm左右,用顯微組織鑷子將肝包膜戳一小口,將腫瘤塊沿隧道嵌入,明膠海綿堵塞竇口,完畢后逐層縫合腹壁,飼養待用。術后肌內注射慶大霉素40 kU/d預防感染。

1.4 分組與處理 采用隨機數字表將40只造模成功大鼠分為對照組與觀察組,各 20只,再次麻醉后固定,剖腹暴露肝臟,分離胃十二指腸動脈、肝動脈及肝固有動脈,結扎胃十二指腸動脈遠端,以銀夾暫時阻斷肝總動脈,于手術顯微鏡下在胃十二指腸動脈上切一小口,插入特制微導管,上行進入肝固有動脈,待回血后,對照組大鼠肝動脈內注入 2～3 m L/ kg阿霉素碘化油乳劑,觀察組給予2～3mL/kg YH-16-阿霉素碘化油乳劑,灌注后拔管,結扎胃十二指腸動脈近端,開放肝總動脈,逐層縫合切口后擦凈傷口,外涂金霉素軟膏,分籠、恒溫、自動供水供食飼養。7 d后處死所有大鼠,剖腹留取腫瘤組織,備用。

1.5 VEGF和MVD的免疫組化檢測 組織標本常規脫水,石蠟包埋,4μm連續切片,采用SABC法進行免疫組化染色。VEGF一抗工作濃度為1∶200,MVD一抗工作濃度為1∶50。以PBS替代一抗作陰性對照。VEGF表達以細胞質內出現淺黃色、棕黃色或褐黃色顆粒為陽性。高倍鏡下每張切片采用圖像分析儀選取 5個視野,每視野計數 100個細胞,計算陽性細胞百分率。參照Weidner方法并加以改進進行微血管計數,凡是染成棕色的單個內皮細胞或內皮細胞成簇出現,并與相鄰血管、腫瘤細胞以及間質成分相分隔的,作為一個微血管計數;首先在低倍鏡下觀看全片,尋找腫瘤內血管清楚且微血管數最多的區域,然后在高倍鏡下計數這一視野的微血管數[5]。

1.6 統計學處理 用SPSS 12.0進行分析,采用兩獨立樣本t檢驗比較2組癌組織中VEGF的表達和MVD,檢驗水準α=0.05。

2 結果

移植瘤組織中VEGF和MVD檢測結果見圖1、表1。

圖1 2組大鼠移植瘤組織中VEGF(A)和MVD(B)的表達1:對照組;2:觀察組。

表1 2組癌組織中VEGF和MVD的檢測結果

3 討論

血管內皮抑素被視為抗腫瘤血管生成治療中最具前途的藥物之一,能封堵VEGF受體VEGFR-1 (Flk-1)、VEGFR-2(Flk-1/KDR)和VEGFR-3(Flk-4),阻斷VEGF介導的信號傳導;阻止血管內皮細胞與VEGF的結合,下調VEGF mRNA和蛋白表達,從而抑制VEGF介導的內皮細胞遷移和血管生成。其抑制血管內皮細胞增殖能力是已發現的血管抑制素的數倍,且作用與劑量呈正相關,不抑制其他細胞的生長,無化療藥物的毒副作用[2,6-9]。

通過介入治療中的導管技術將化療藥物送達腫瘤供血動脈可延長藥物和腫瘤細胞的接觸時間,提高局部的藥物濃度,減少全身反應[10]。單純的TACE主要針對已經生成的腫瘤血管,對新生的血管無栓塞作用;而血管內皮抑素主要抑制腫瘤新生血管,對于已經形成的血管作用不大。二者聯合可以互補,在阻斷腫瘤供血的同時抑制新生血管的生成,從而達到致腫瘤壞死同時抑制新生腫瘤的復發、轉移的作用[11]。

作者的實驗結果顯示,與對照組相比,觀察組大鼠Walker-256肝癌移植瘤組織內VEGF的表達和MVD表達下降,提示YH-16使腫瘤新生血管的形成明顯減少,YH-16聯合TACE可有效對抗血管生成。

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