導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)在人乳頭瘤病毒基因分型中的應(yīng)用

張 藝

鄭州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科鄭州 450007

人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)是一種小分子雙鏈DNA病毒,可致人類皮膚和黏膜異常增生,是誘發(fā)女性宮頸癌及生殖器病變的主要病源。在超過(guò) 95%的早期浸潤(rùn)和浸潤(rùn)性宮頸癌中,至少發(fā)現(xiàn)20種致癌 HPV亞型,根據(jù)其致病性差異可分為高危型和低危型[1],其中高危型 HPV與宮頸癌和宮頸上皮瘤變有關(guān),低危型HPV與外生殖器尖銳濕疣等良性病變有關(guān)[2]。作者對(duì)鄭州市中心醫(yī)院就診的354例宮頸糜爛患者進(jìn)行HPV基因分型檢測(cè),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選擇 2008年 10月至 2010年 8月鄭州市中心醫(yī)院婦科收治的宮頸糜爛患者共 354例,年齡 20～63歲。標(biāo)本采集:將專用宮頸刷置于宮頸口,輕輕搓動(dòng)宮頸刷使其順時(shí)針旋轉(zhuǎn) 5圈,取出宮頸刷,折斷刷頭置入加有專用細(xì)胞保存液的取樣管中,擰緊瓶蓋。4℃保存,2周內(nèi)檢測(cè)。

1.2 儀器與試劑 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI 7300),HybriMax醫(yī)用核酸分子快速雜分儀(中國(guó)凱普生物科技有限公司)。HPV DNA抽提試劑盒、HPV基因分型檢測(cè)試劑盒(中國(guó)凱普生物科技有限公司),可檢出 21種亞型,包括高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和 68),低危型(6、11、42、43和 44)及3種中國(guó)人群常見(jiàn)高危型(53、66和CP8304)。

1.3 DNA提取及HPV各基因型檢測(cè)方法 取宮頸細(xì)胞保存液0.5mL,14 000 r/min離心5 min,棄上清液,按HPV DNA抽提試劑盒提取DNA。PCR擴(kuò)增:反應(yīng)總體系 25μL,每次實(shí)驗(yàn)設(shè)一個(gè)陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照。PCR反應(yīng)條件為20℃10 min;95℃9min;循環(huán)40次(95℃20 s,55℃30 s,72℃30 s); 72℃延伸5 min。導(dǎo)流雜交:①取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物20 μL,95℃加熱5 min,冰水浴2m in。②雜交孔內(nèi)加入1m L預(yù)熱至45℃的雜交液。③把步驟①制備的已變性DNA樣品溶液加入0.5 mL預(yù)熱至45℃的雜交液,混勻,加在芯片薄膜上溫育10 min后開(kāi)泵進(jìn)行導(dǎo)流雜交。④45℃條件下,預(yù)熱 45℃雜交液沖洗膜 3次。用凱普專用閱讀儀對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。每張芯片上均設(shè)有PCR反應(yīng)質(zhì)控點(diǎn)和雜交顯色質(zhì)控點(diǎn)各一個(gè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0進(jìn)行分析,對(duì)不同年齡組HPV感染人數(shù)行χ2檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

354例宮頸糜爛患者中,HPV陽(yáng)性率為37.8% (134/354),21種HPV亞型均被檢出,共檢測(cè)出230例次。HPV各基因分型檢出例次見(jiàn)表 1。不同年齡組HPV的感染情況比較結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 HPV各基因分型檢出例次比較(n=354)

表2 不同年齡組HPV的感染情況比較

3 討論

在HPV的基因型檢測(cè)中,目前主要采用實(shí)時(shí)熒光PCR法及雜交捕獲法。導(dǎo)流雜交技術(shù)將基因PCR擴(kuò)增技術(shù)及基因芯片技術(shù)集于一身,最大限度地發(fā)揮了上述技術(shù)的特點(diǎn),有較高的敏感度和特異性,可檢測(cè) 21種HPV亞型,而且包含了3個(gè)中國(guó)人常見(jiàn)的高危亞型,增加了HPV各亞型尤其是高危型HPV亞型感染的檢出率及不同亞型復(fù)合感染的檢出率,并可在數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得結(jié)果,能為患者和臨床提供非常有價(jià)值的診療依據(jù),是目前較好的HPV分型檢測(cè)方法[3]。

據(jù)WHO研究[4]統(tǒng)計(jì),曾感染HPV的人數(shù)在性活躍期男女中的比率為 40%,它們廣泛存在于成年人族群中,一般 HPV感染者無(wú)臨床癥狀,大部分感染了HPV的婦女將會(huì)發(fā)展為輕度宮頸損傷,而大多數(shù)輕度損傷都可以自行恢復(fù),只有持續(xù)存在的高危感染才可能引起癌前病變。作者在 354例標(biāo)本中共檢出134例HPV感染者,HPV感染率為37.8%;21種基因型均被檢出。高危型主要是 16、18型,與文獻(xiàn)[5]結(jié)果一致。從表2可看出20～歲年齡段HPV感染率較高,其次為 31～歲年齡組,這可能和這個(gè)年齡段性活躍有關(guān)。單一低危型感染患宮頸癌或高度病變的風(fēng)險(xiǎn)很低,而高危型感染、持續(xù)感染患宮頸癌或高度病變的風(fēng)險(xiǎn)增大[6]。因此,準(zhǔn)確檢測(cè)HPV感染及其分型對(duì)宮頸癌篩查、早期確診及預(yù)后判斷等具有重要的臨床意義。

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