順鉑對TRAIL誘導EC1細胞凋亡的增敏效應*

江亞南,馬俊芬,黃幼田,李 沛,李芳芳,楊 浩,董子明#

1)鄭州大學基礎醫學院病理生理學教研室鄭州 450001 2)鄭州大學基礎醫學院臨床醫學系鄭州 450001

#通訊作者,男,1954年4月生,博士,教授,研究方向:食管癌DNA聚合酶β與癌變機制,E-mail:dongzm@zzu.edu.cn

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是腫瘤壞死因子超家族中凋亡誘導成員中的一員,已被認為是腫瘤治療中新的生物制劑[1]。TRAIL主要通過誘導對其敏感的腫瘤細胞凋亡來發揮抗腫瘤作用,對正常細胞包括肝細胞和骨髓細胞幾乎無毒性。不同組織類型的癌細胞對TRAIL的敏感性不同,有研究[2]表明聯合化療或放療均可以明顯提高TRAIL對不敏感腫瘤細胞的凋亡誘導作用。該研究中作者通過TRAIL或順鉑(cDDP)單獨以及二者聯合應用,觀察cDDP對TRAIL誘導食管癌EC1細胞凋亡的增敏作用,為TRAIL用于食管癌的生物治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 TRAIL購自美國R＆D公司,cDDP由山東齊魯制藥廠生產,MTT購自美國Sigma公司,小牛血清購自天津TBD公司,RPMI 1640培養粉購自美國Gibco公司,二甲基亞砜購自美國Sigma公司。AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒購自寶賽生物公司,細胞周期試劑盒購自美國BD公司,碘化吡啶購自美國Sigma公司。EC1細胞系由香港大學曹世華教授惠贈。

1.2 細胞培養 EC1細胞在含有體積分數10%的胎牛血清,100 U/m L青霉素,100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養液中,于37℃,體積分數為5%CO2孵箱中培養。0.2 g/L乙二胺四乙酸和0.5 g/L胰蛋白酶混合液消化、傳代、備用。

1.3 不同質量濃度的TRAIL或cDDP作用不同時間對EC1細胞增殖的影響 采用MTT法。取處于對數生長期的細胞,調整細胞濃度為 4×104m L-1,接種于 96孔板。分別加入終質量濃度為 0、10、50、100、500和 1 000μg/L的TRAIL及0、1.0、2.0、4.0、10.0和20.0 mg/L的cDDP,均設5個復孔。分別作用24、48和72 h后,每孔加入MTT 20μL,繼續培養4 h后去上清,每孔加入 150μL二甲基亞砜,振蕩10min,在酶標儀上以空白對照孔調零,570 nm處讀取吸光度值(A)。細胞增殖率=(實驗孔平均A值/對照孔平均A值)×100%。

1.4 TRAIL與cDDP單用或聯用對EC1細胞凋亡的影響 取5×104個EC1細胞接種于培養瓶,以IC50cDDP(10.0mg/L)和治療劑量TRAIL(100μg/ L)單獨或聯合作用于EC1細胞,48 h后收集細胞,同時設未加藥物的空白對照組。PBS液洗滌 2遍,再用體積分數70%乙醇固定,4℃過夜,按AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測試劑盒步驟操作,上流式細胞儀檢測細胞凋亡,分析細胞凋亡率。

1.5 TRAIL和cDDP單用或聯用對EC1細胞周期的影響 取EC1細胞,同1.4項分組處理后,用0.5 g/L胰蛋白酶消化,2 000 r/m in離心8 min,棄上清;用PBS洗2遍,離心后棄上清,加入體積分數70%冰乙醇固定,4℃過夜;上機前,2 000 r/ min離心8min,棄去乙醇,PBS洗2遍;加入1 mL PBS制成細胞懸液,按細胞周期試劑盒步驟操作,上流式細胞儀檢測細胞周期,每個樣本檢測 10 000個細胞。

1.6 統計學處理 采用SPSS 10.0進行分析。應用 3×5析因設計的方差分析比較不同質量濃度的TRAIL與cDDP作用不同時間對EC1細胞增殖的影響,應用2×2析因設計的方差分析比較TRAIL或cDDP單用及聯用對EC1細胞凋亡和細胞周期的影響,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 不同質量濃度TRA IL或cDDP作用不同時間對EC1細胞增殖的影響 見表 1、2。

表1 不同質量濃度TRAIL作用不同時間對EC 1細胞增殖的影響(n=5) %

表2 不同質量濃度cDDP作用不同時間對EC 1細胞增殖的影響(n=5) %

2.2 TRAIL與cDDP單用或聯用對EC1細胞凋亡率的影響 見表3。

表3 TRAIL與cDDP單用或聯用對EC 1細胞凋亡率的影響(n=5) %

2.3 TRA IL和cDDP單用或聯用對EC1細胞周期的影響 見表4～6。

表4 TRA IL和cDDP單用或聯用對EC 1細胞G0/G1期的影響(n=5) %

表5 TRA IL和cDDP單用或聯用對EC 1細胞G2/M期的影響(n=5) %

表6 TRA IL和cDDP單用或聯用對EC 1細胞S期的影響(n=5) %

3 討論

應用細胞因子對腫瘤進行生物學治療是近年來國內外學者研究的一個重要方向。TRAIL可以特異地誘導腫瘤細胞凋亡而對正常細胞幾乎沒有作用,但是多種腫瘤細胞對其并不敏感[3-5]。該實驗結果顯示EC1細胞的增殖不隨TRAIL作用時間或質量濃度的增加而改變,表明EC1對TRAIL并不敏感。如何增加食管癌EC1細胞對TRAIL的敏感性是TRAIL更好地應用于食管癌臨床治療的關鍵問題。

有文獻[6-7]表明臨床常用化療藥物 cDDP和TRAIL聯用可以增加多種腫瘤細胞對TRAIL的敏感性。cDDP是目前食管癌化療中的常用藥物,具有廣泛的抗瘤譜。在大量或長期應用后,常引起耳腎毒性及產生耐藥性而導致化療失敗[8-9]。該研究結果示cDDP對EC1細胞的增殖有抑制作用,且隨著cDDP作用時間和質量濃度的增加而增強。作者將IC50cDDP和治療劑量的TRAIL聯合作用于EC1細胞48 h,結果顯示單用TRAIL對EC1細胞的凋亡影響不大,但是與cDDP聯合作用后,EC1細胞的凋亡率升高,表明cDDP對TRAIL誘導EC1細胞凋亡有增敏效應,為TRAIL用于食管癌的臨床治療提供了實驗依據。

細胞周期被阻滯于不同檢測點的意義不同:細胞阻滯在G1期檢查點,可防止DNA受損的細胞進入S期復制;阻滯在S期檢查點,可防止DNA復制不完全細胞進入 G2/M期;阻滯在G2期檢查點,防止在 M期進行異常分裂[9]。該研究結果顯示單用cDDP或TRAIL并不明顯影響EC1細胞周期,而二者聯合可將EC1細胞阻滯于G2/M期。具體機制有待于進一步研究。

[1]Jin H,Yang R,Fong S,et al.Apo2 ligand/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand cooperates with chemotherapy to inhibit orthotopic lung tumor grow th and improve survival[J].Cancer Res,2004,64(14):4900

[2]AshkenaziA,PaiRC,Fong S,etal.Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo2 ligand[J].JClin Invest,1999,104(2):155

[3]Vignati S,Codegoni A,Polato F,et al.Trail activity in human ovarian cancer cells:potentiation of the action of cytotoxic drugs[J].Eur JCancer,2002,38(1):177

[4]Pan G,O'Rourke K,Chinnaiyan AM,et al.The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL[J].Science,1997,276 (5309):111

[5]徐玉生,許建中,苗金紅,等.順鉑、TRAIL單獨或聯合應用對橫紋肌肉瘤細胞生長的影響[J].鄭州大學學報:醫學版,2006,41(4):691

[6]Wiezorek J,Holland P,Graves J.Death receptor agonists as a targeted therapy for cancer[J].Clin Cancer Res, 2010,16(6):1701

[7]Mahmood Z,Shukla Y.Death recep tors:targets for cancer therapy[J].Exp Cell Res,2010,316(6):887

[8]郝秀輕,張林西,孫黎,等.NS-398聯合順鉑對Eca-109細胞增殖及凋亡的影響[J].鄭州大學學報:醫學版,2010,45(5):713

[9]Kermp ler A,Deckbar D,Jeggop A,et al.An imperfect G2M checkpoint contributes to chromosome instability following irradiation of S and G2 phase cells[J].Cell Cycle, 2007,6(14):1682