阿托伐他汀對糖尿病ApoE基因敲除小鼠組織中CD55和CD59表達的影響

馬西文 秦明照 趙煥英 常志文 張 勇 宋愛麗

1)河南大學附屬鄭州市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌老年病科 鄭州 450004 2)首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院 北京 100730 3)首都醫(yī)科大學 北京 100069

糖尿病性腦血管病包括顱內(nèi)大血管病變和微血管病變,顱內(nèi)大血管病變的主要病理學改變?yōu)閯用}粥樣硬化(atherosclerosis,AS)。AS進程加速是糖尿病患者致死致殘的主要原因。他汀類藥物是目前臨床應用廣泛、有效的抗AS藥物。除調(diào)脂作用外,他汀類藥物還具有減輕炎癥、抗氧化、改善血管內(nèi)皮功能、抑制細胞增殖和免疫調(diào)節(jié)等多種作用[1]。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),他汀類藥物能夠上調(diào)CD55和(或)CD59表達[2-3]。但在糖尿病大血管病變組織中,他汀類藥物對CD55和CD59表達的影響尚不清楚。

本研究通過ApoE基因敲除(ApoE knock out,ApoE-/-)小鼠建立糖尿病動脈粥樣硬化動物模型,運用免疫熒光和實時定量聚合酶鏈反應技術,觀察阿托伐他汀對糖尿病動脈粥樣硬化小鼠主動脈組織中補體調(diào)節(jié)蛋白CD55和CD59表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:雄性6周齡C57BL/6遺傳背景的ApoE-/-小鼠22只,平均體質量(21.27±2.52)g,購自于北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部(SPF/VAF級,許可證號:SCXK(京)2006-0008)。動物飼養(yǎng)場地:首都醫(yī)科大學附屬北京口腔醫(yī)院動物室(SPF級,許可證號:SYXK(京)2005-0031)。普通鼠飼料購于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心(SPF級,許可證號:SCXK(軍)2007-005)。

1.1.2 試劑:一抗:CD55(s-15),美國Santa Cruz公司,批號B2105;CD59(FL-123),美國Santa Cruz公司,批號C1606。二抗:TRITC-兔抗山羊IgG(H+L),北京中杉金橋生物技術有限公司,批號76925;FITC-豬抗兔IgG,丹麥Dako公司,批號C00032594。

1.2 方法

1.2.1 建立糖尿病動脈粥樣硬化模型[4]:將22只雄性6周齡ApoE-/-小鼠飼養(yǎng)于室溫25℃、12/12 h光照/黑暗交替環(huán)境中,每籠5只,普通飼料喂養(yǎng),自由進食水。適應1周后,建立糖尿病動脈粥樣硬化動物模型。步驟如下:將小鼠編號、稱重,按55 mg?kg-1?d-1體質量計算鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)用量(Sigma S0130,美國Sigma-Aldrich公司,批號071K7604),1次/d,連續(xù)5 d腹腔注射。1周后剪尾法取血測血糖,血糖值＞11.1 mmol/L即為造模成功[5]。22只小鼠20只造模成功,2只小鼠血糖＜11.1 mmol/L棄去不用。

1.2.2 實驗動物分組及給藥方案:分為2組,糖尿病動脈粥樣硬化(對照)組10只,蒸餾水灌胃;阿托伐他汀干預(干預)組10只,阿托伐他汀(中美輝瑞制藥有限公司惠贈)灌胃(10 mg?kg-1?d-1體質量)[6]。

1.2.3 標本采集及檢測:藥物干預8周后,據(jù)體質量給予1%戊巴比妥鈉(50 mg?kg-1體質量)腹腔注射麻醉處死。采用摘眼球法取血,取血前全部小鼠禁食水3小時[5]。獲取血標本,應用Unicel DxC 800型全自動生化分析儀(美國Beckman公司)測定血脂,ELISA試劑盒檢測小鼠血清淀粉樣蛋白-A(serum amyloid-A,SAA)水平(美國Rapid Bio公司,批號23050802);剪尾法取血,采用羅氏血糖儀(德國Roche公司)檢測血糖水平。觀察動脈粥樣硬化病變情況,計算斑塊面積大小,比較阿托伐他汀干預前后CD55和CD59蛋白水平及mRNA水平表達變化。

1.2.4 計算動脈粥樣硬化斑塊面積[7]:每組5只小鼠留取主動脈全長,顯微鏡下縱剖。常規(guī)蘇丹Ⅳ染色后,×4倍鏡下實域分割,每條主動脈取6個視野,經(jīng)Daheng Imavision HV Camera Performance圖像采集系統(tǒng)采集圖像,使用M otic 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析軟件測量斑塊面積。尺寸定標值1 μ m,光密度定標值255,計算平均斑塊面積。

1.2.5 免疫熒光檢測小鼠主動脈組織CD55和CD59蛋白表達:每組5只小鼠留取主動脈弓組織,-20℃連續(xù)切片,厚度7 μ m,每隔4張取片1張,共4張。置-20℃冰丙酮中固定5 min,室溫晾干;入無水乙醇中5 min,室溫晾干;PBS水洗3次;用3%正常兔血清室溫封閉1 h;移去封閉液,滴加一抗:CD55(濃度1∶200)和CD59(濃度1∶200),置于濕盒內(nèi),4℃過夜;PBS水洗3次;滴加二抗:TRITC-兔抗山羊IgG(H+L)(濃度1∶50)和FITC-豬抗兔IgG(濃度1∶20),避光置于濕盒內(nèi),室溫1 h;避光PBS水洗3次;90%甘油/PBS封片。采用DM4000B型顯微鏡(德國Leica公司)觀察CD55和CD59蛋白表達。

1.2.6 Real-time PCR檢測小鼠主動脈組織CD55和CD59 mRNA表達:Trizol試劑(美國Sigma-Aldrich公司,批號116K1801)抽提總RNA,DU800型紫外分光光度儀(美國Beckman Coulter公司)測OD值(260 nm/280 nm)及濃度;采用First Strand cDNA合成試劑盒(英國BioLabs公司,產(chǎn)品號E6500s)逆轉錄為cDNA;使用引物設計軟件Primer express 3.0(美國ABI公司)設計引物,序列為:CD55:上游(87-106)5'-CCCAACTGTACGCGGAGACT-3',下游(148-130)5'-CCAAGATTGGCCTGGCAT T-3';CD59:上游(114-134)5'-GCTGCT TCTGGCTGTGTTCTG-3',下游(175-153)5'-GTTGGAAACAGTGGTAGCATGTG-3';GAPDH:上游(684-703)5'-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3',下游(738-722)5'-GCGGCACGTCAGATCCA-3'。

按下列比例配制反應體系:SYBR Green(英國ABI公司,批號0412165)10μ L,上下游引物的混合液1 μ L,cDNA模板1 μ L,去酶水8μ L,總量20 μ L;將配好的反應體系上機反應(ABI7300,美國ABI公司)。反應條件:95℃,5 min;95℃,15 s;57℃,30 s;72℃,30 s。共60個PCR循環(huán)。擴增反應結束后建立PCR產(chǎn)物熔解曲線。

1.3 統(tǒng)計學分析 計量資料用均數(shù)±標準差表示,非正態(tài)資料經(jīng)對數(shù)轉換。組間比較用獨立樣本t檢驗。全部數(shù)據(jù)采用SPSS for Windows 11.5統(tǒng)計軟件,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般指標和動脈粥樣硬化斑塊面積比較 與對照組相比,阿托伐他汀干預后體質量增加[(18.2±1.7)g vs.(27.9±1.1)g,P=0.000],血糖水平差異無統(tǒng)計學意義[(29.4±4.2)mmol/L vs.(24.6±7.4)mmol/L,P=0.240,P＞0.05]。血脂方面,阿托伐他汀干預后2組總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義[(18.4±1.75)mmol/L vs.(31.6±17.0)mmol/L,(1.0±0.3)mmol/L vs.(1.1±0.5)mmol/L,(14.6±2.0)mmol/L vs.(23.4±13.3)mmol/L,(6.3±0.6)mmol/L vs.(8.9±4.9)mmol/L,P值分別為0.120、0.706、0.179、0.287,P均＞0.05]。阿托伐他汀干預后SAA水平有減少趨勢[(3.8±1.6)μ g/mL vs.(5.9±3.2)μ g/mL,P=0.230,P＞0.05]。同樣,平均動脈粥樣硬化斑塊面積也呈下降趨勢[(218752.4±87927.16)μ m2vs.(264046.4±88374.97)μ m2,P=0.221,P＞0.05]。

2.2 小鼠主動脈組織中CD55和CD59蛋白水平比較 用免疫熒光染色觀察小鼠主動脈組織中CD55和CD59表達情況,可見CD55和CD59主要表達在血管內(nèi)皮層。與對照組相比,阿托伐他汀干預8周后,CD55和CD59蛋白表達強度均有增強。見圖1、2。

2.3 各組小鼠主動脈組織中CD55和CD59 mRNA水平表達 每組5只小鼠留取胸和腹主動脈組織行Real-time PCR檢測。與對照組相比,阿托伐他汀干預8周后,2組CD55和CD59 mRNA相對表達量無明顯變化(0.55±0.2 vs.0.43±0.11,0.76±0.36 vs.0.55±0.13,P值分別為0.616、0.605,P均＞0.05)。

3 討論

補體系統(tǒng)活化有三條途徑:經(jīng)典途徑、旁路途徑和甘露聚糖結合凝集素途徑。三條途徑活化后形成C3/C5轉化酶,最終產(chǎn)生膜攻擊復合物導致靶細胞溶解。然而,除了溶細胞效應,補體級聯(lián)反應對自身組織也可造成潛在的損傷。CD55和CD59是膜結合的補體調(diào)節(jié)蛋白,CD55作用于C3/C5轉化酶,CD59阻止膜攻擊復合物裝配形成,從而保護自身細胞免受補體的損傷。

糖尿病大血管病變主要發(fā)生在心、腦及下肢,是糖尿病患者死亡的主要原因,基本病理變化是動脈粥樣硬化。美國心臟保護研究(heart protection study,HPS)結果顯示,他汀類藥物治療能使糖尿病卒中、冠心病和血管重建的危險性下降34%。他汀類藥物是目前臨床應用廣泛有效的調(diào)脂藥物。除調(diào)脂作用外,他汀類藥物還具有減輕炎癥、抗氧化、改善血管內(nèi)皮功能、抑制細胞增殖和免疫調(diào)節(jié)等多種作用[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)[8],糖尿病大血管病變患者外周血白細胞CD55和CD59表達下調(diào);同時,他汀類藥物有上調(diào)外周血白細胞CD55和CD59表達的趨勢。但他汀類藥物對糖尿病大血管病變組織中CD55和CD59表達的影響尚未見報道。

具有C57BL/6遺傳背景的ApoE-/-小鼠,可以在喂食普通飼料情況下,15周齡時形成復雜的AS病變,其斑塊分布及病理特征與人類AS斑塊極為相似[9];給予ApoE-/-小鼠多次小劑量腹腔注射鏈脲佐菌素,成模后6周,在主動脈弓及胸主動脈主要分叉處可形成明顯的AS纖維斑塊病變,是研究糖尿病動脈粥樣硬化較好的動物模型[10]。給予ApoE-/-小鼠喂養(yǎng)普通飼料,連續(xù)5次腹腔注射STZ,成模8周后處死。結果顯示,糖尿病動脈粥樣硬化組體質量減輕,血脂增高,主動脈根部至主動脈弓AS病變面積增大。免疫熒光顯示,小鼠CD55和CD59主要表達在主動脈內(nèi)膜和外膜,中膜未見明確表達,與文獻報道結果相似[11]。

他汀類藥物是3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A(hydroxymethyl-glutaryl coenzyme A,HMG-CoA)還原酶抑制劑,主要用于控制血脂水平。體外研究發(fā)現(xiàn),他汀類藥物能誘導CD55表達[2];在高脂血癥患者體內(nèi),他汀類藥物上調(diào)了外周血白細胞CD59表達[3]。為觀察他汀類藥物對糖尿病動脈粥樣硬化組織中CD55和CD59表達的影響,本研究給予小劑量阿托伐他汀干預8周,結果顯示,與糖尿病動脈粥樣硬化組相比,他汀組血脂水平無明顯降低,SAA水平和AS病變面積有下降趨勢,主動脈組織中CD55和CD59蛋白表達強度增強,mRNA水平無變化。提示阿托伐他汀可上調(diào)小鼠主動脈組織中CD55和CD59蛋白水平的表達。

近年來研究表明,他汀類藥物具有許多降脂以外的作用,包括抗炎、改善血管內(nèi)皮功能、抗氧化、抑制心肌細胞凋亡、穩(wěn)定AS斑塊等[1]。炎癥因子、細胞凋亡均可活化補體,導致補體調(diào)節(jié)蛋白的下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn),阿托伐他汀干預后炎癥因子SAA水平下降,可能是上調(diào)CD55和CD59蛋白水平表達的原因之一;阿托伐他汀干預后AS斑塊面積減少,但差異無統(tǒng)計學意義,可能與樣本量較少有關。此外,體外研究發(fā)現(xiàn)[2],他汀類藥物可通過PKCa介導的途徑和抑制RhoA上調(diào)CD55的表達來達到早期抗AS的目的,但糖尿病患者AS進程加速。在高血糖狀態(tài)下他汀類藥物上調(diào)補體調(diào)節(jié)蛋白的機制有無變化值得進一步研究。

[1] Davig non J.Beneficial cardiovascular pleiotropic effects of statins[J].Circulation,2004,109(23 suppl 1):III39-43.

[2] M ason JC,Ahmed Z,M ankoff R,et al.Statin-induced expression of decay-accelerating factor protects vascular endothelium against complement-mediated injury[J].Circ Res,2002,91:696-703.

[3] 劉永銘,何津春,楊京港,等.阿托伐他汀對高脂血癥患者補體調(diào)節(jié)蛋白CD55、CD59表達的影響[J].中華心血管病雜志,2005,33(12):1 075-1 079.

[4] Fujii A,Allen TJ,Nestel PJ.A 1,3-diacylglycerol-rich oil induces less atherosclerosis and lowers plasma cholesterol in diabetic apoE-deficient mice[J].Atherosclerosis,2007,193:55-61.

[5] Zuccollo A,Shi C,Mastroianni R,et al.T he thromboxane A2 receptor antagonist S18886 prevents enhanced atherogenesis caused by diabetes mellitus[J].Circulation,2005,112:3 001-3 008.

[6] Pospisilova N,Semecky V,Jamborova G,et al.Endolin expression in hyper-cholesterolemia and after atorvastatin treatment in apoE-deficient mice[J].J Pharm Sci,2006,9(3):388-397.

[7] 趙全明,顏東,宋愛麗,等.羅格列酮對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的影響[J].中華心血管病雜志,2005,33(5):399-404.

[8] M a Xiwen,Chang Zhiwen,Qin Mingzhao,et al.Decreased expression of complement regulatory proteins,CD55 and CD59,on peripheral blood leucocy tes in patients with type 2 diabetes and macrovascular diseases[J].CMJ,2009,122:2 123-2 128.

[9] Nakashima Y,Plump AS,Raines EW,et al.ApoE-deficient mice develop lesions of all phases of atherosclerosis throug hout the arterial tree[J].Arterioscler T hromb,1994,141:133-140.

[10] Park L,Raman KG,Lee KJ,et al.Suppression of accelerated diabetic atherosclerosis by the soluble receptor for advanced glycation endproducts[J].Nat M ed,1998,4:1 025-1 031.

[11] Yasojima K,Schwab C,McGeer EG,et al.Complement components,but not complement inhibito rs,are upregulated in atherosclerotic plaques[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2001,21:1 214-1 219.