β-七葉皂甙鈉對腦缺血-再灌注損傷大鼠自由基的影響

劉 梅 李小剛 譚 華

1)成都市第六人民醫院神經內科 成都 610000 2)瀘州醫學院附屬醫院神經內科 瀘州 646000

腦缺血-再灌注損傷是多種致病因素共同作用互相促進的結果。缺血性腦血管病在治療上強調早期綜合治療。β-七葉皂甙鈉已被應用于腦水腫及腦神經功能失調,具有消水腫及清除自由基,改善微循環,抑制細胞凋亡等作用[1],從而減輕缺血-再灌注損傷,達到保護神經細胞的作用。我們旨在研究β-七葉皂甙鈉在自由基方面對缺血再灌注損傷的影響,為臨床治療提供更多的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠45只,體質量200～300 g;隨機分為3組:假手術組(n=15)、缺血-再灌注組(n=15)和β-七葉皂甙鈉治療組(n=15)。治療組再灌注即刻腹腔內注射β-七葉皂甙鈉注射液(10 mg/kg),缺血-再灌注組將β-七葉皂甙鈉換成等毫升生理鹽水。

1.2 方法

1.2.1 栓線的處理:為保證能完全堵住MCA的起點,并避免傷及血管內皮和刺破血管,應對線栓頭端進行“鈍化”處理,將尼龍線放入0.1%多聚賴氨酸中浸泡10 h,然后取出,在60℃烘箱中干燥1 h備用,使線栓頭變得略鈍圓。整個過程并不改變尼龍線的直徑。

1.2.2 大鼠缺血-再灌注模型的制作:采用Zea Longa[2]的大腦中動脈線栓法并加以改進,將動物仰臥固定于手術臺上,分離右側頸總動脈和頸內動脈及頸外動脈,結扎頸外動脈和頸總動脈,在頸內動脈下方穿一提拉線以暫時阻斷血流,在頸總動脈距分叉處將尼龍線插入頸總動脈,進入頸內動脈,結扎頸內動脈下方栓線并固定。缺血2 h后輕輕拔出栓線,形成再灌注。根據Bederson等[3]評定方法分為0～3級。0級:向地面伸展兩前肢,未見行為異常;1級:腦損傷對側前肢持續屈曲;2級:腦損傷對側前肢屈曲,腦損傷對側肩內收但無扭轉,側推抵抗力弱;3級:腦損傷對側前肢屈曲,腦損傷對側肩內收且有扭轉,側推抵抗力弱。神經癥狀達1～3級之一者判斷為模型成功。入選動物斷頭取腦時發現有蛛網膜下腔出血則棄之不用。

1.3 觀測指標

1.3.1 神經功能缺失評分:采用Zea Longa[2]的評分方法。大鼠局灶性腦缺血-再灌注后經功能缺損評分:0分,無神經系統功能缺失,活動正常;1分,不能完全伸展對側前爪;2分,爬行時出現向癱瘓側轉圈;3分,爬行時向癱瘓側傾倒;4分,不能自行行走,有意識障礙。得分越高表明神經功能缺損程度越重,相反損害較輕。

1.3.2 腦組織光鏡觀察:每組隨機選取5只動物,取缺血區及其周邊腦組織,固定于4%甲醛中,4℃冰箱保存,常規石蠟切片,HE染色,光鏡觀察病理形態改變。

1.3.3 術后腦組織TTC染色:將假手術組和缺血-再灌注組的大鼠迅速斷頭取腦,去除低位腦干和小腦,將腦組織置入4%TTC溶液中,在37℃條件下孵育30 min,每4～5 min翻動一次。

1.3.4 腦缺血區SOD和MDA含量的測定:于相應各時間點(缺血2 h后再灌注6 h、12 h、24 h)斷頭截取缺血側皮層腦組織,稱重后制成10%的腦組織勻漿,按照試劑盒采用放射免疫法測定SOD和MDA含量。

1.4 統計學處理 應用SPSS 11.0統計軟件進行分析,所有數據采用±s表示,組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 神經功能損害評分 假手術組動物無明顯神經功能缺失,治療組和缺血-再灌注組動物均有不同程度的神經功能缺失,且治療組神經功能缺失有所改善,呈減輕趨勢,P＜0.05。見表1。

2.2 腦缺血-再灌注模型TTC染色 TTC目前被認為是腦組織缺血性損傷的標記物[4]。T TC能與正常線粒體氧化酶系統發生反應而降解成深紅色的脂溶性化合物。受損線粒體缺乏降解T TC的酶而呈現白色使得受損組織與正常組織極易區分開來。TTC染色已被用于標記腦梗死面積[4]。由于正常腦組織的酶使TTC分解變紅色,所以TTC染色時,正常腦組織呈紅色,梗死灶呈白色[4]。從圖1我們可以看到,假手術組腦組織呈紅色,缺血-再灌注組大鼠皮質梗死區呈蒼白色,未缺血區呈紅色,與大腦中動脈支配的腦區一致,間接說明模型造模成功(見圖1～2)。

表1 術后各組神經功能損害評分 (±s)

表1 術后各組神經功能損害評分 (±s)

組 別n各時間點術后6 h 術后12 h 術后24 h假手術組150*0*0*缺血-再灌注組152.8±0.842.8±0.452.6±0.55治療組151.8±0.84*1.6±0.55*1.2±0.45*

2.3 病理結構改變(HE染色) 假手術組腦組織的結構較完整,缺血-再灌注組腦組織可見缺血壞死區,細胞水腫明顯,神經元崩解為大量的無定形組織,呈嗜伊紅染色,也可見膠質細胞增生;治療組也可見神經元壞死,但殘留的神經元較多,細胞水腫程度相對較輕。見圖3～5。

2.4 術后各組腦組織SOD含量的變化 見表2。缺血-再灌注組和治組SOD含量顯著低于假手術組相(P＜0.05),治療組SOD含量明顯高于缺血-再灌注組,差異具有統計學意義(P＜0.05)。

2.5 術后各組腦組織M DA含量的變化 見表3。缺血-再灌注組和治療組MDA含量顯著高于假手術組(P＜0.05);治療組MDA含量與缺血-再灌注組比較明顯降低(P＜0.05)。

表2 術后各組腦組織SOD含量的測定(±s,U/mL)

表2 術后各組腦組織SOD含量的測定(±s,U/mL)

組 別n各時間點(n=5)術后6 h 術后12 h 術后24 h假手術組15 29.21±1.24*#29.45±0.64*#30.08±0.63*#缺血-再灌注組15 15.82±0.5818.05±1.0020.62±0.80治療組15 18.75±0.75*20.88±0.48*23.21±0.72*

表3 術后各組腦組織MDA含量的測定(±s,nmol/mL)

表3 術后各組腦組織MDA含量的測定(±s,nmol/mL)

組 別n各時間點(n=5)術后6 h 術后12 h 術后24 h假手術組15 6.18±0.22*#6.18±0.23*#6.19±0.23*#缺血-再灌注組15 13.72±0.512.32±1.0110.30±0.88治療組15 11.71±0.74*9.77±0.82*8.02±0.44*

3 討論

目前臨床上對于缺血性腦梗死的治療,目的主要是保護缺血半暗帶,阻止其發展成不可逆的缺血性損傷,超早期溶栓治療為缺血腦組織的再灌注提供了可能性,但再灌注的同時引起的氧自由基大量釋放。自由基是一類具有高度化學反應活性的毒性很強的代謝產物。MDA作為氧自由基與生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的代謝產物,其含量的變化間接地反應了腦組織中氧自由基含量的變化,因此通過測定MDA含量可以估價腦組織中氧自由基含量和組織損傷程度[5]。SOD是一種帶負電荷的蛋白質,SOD進入腦細胞漿、細胞外間隙,通過歧化的方式發揮清除超氧陰離子自由基的作用[6]。SOD在組織中的含量常作為清除氧自由基能力的主要指標。

本實驗結果顯示,假術組中SOD和MDA含量在三個不同時間點無明顯變化,缺血-再灌注組腦組織SOD和MDA含量與假手術組各時間點比較,SOD含量明顯降低,MDA含量顯著升高。在缺血-再灌注組中,SOD在缺血-再灌注后6 h活性最低,隨著時間延長活性逐漸增強;MDA在缺血-再灌注后6 h時含量最高,12 h時逐漸降低,在24 h時含量最低,三個時間點比較差異具有統計學意義,MDA降低和SOD升高呈負相關,這說明氧自由基參與了腦缺血-再灌注損傷過程;隨著腦組織損傷程度的加重,氧自由基釋放大量增加,代謝產物逐漸增加,故MDA含量增加,但機體隨之啟動清除自由基系統,故SOD含量雖然在6 h時活性相對較低,12 h后開始逐漸增加,24 h時達高峰。不過,由于我們沒有對腦缺血-再灌注后30 min、1 h或48 h甚至更多的時間點進行觀察,故不能判斷SOD和MDA的動態變化過程,如機體還沒完全調動抗自由基系統,SOD是否在6 h時活性最低、在什么時候出現高峰、有沒有2次高峰等情況。自由基可能通過以下機制加重缺血性腦損傷:(1)自由基的代謝產物可攻擊細胞的脂類、蛋白質及核酸等成分,其中活性氧自由基對生物膜(膜上多價不飽和脂肪酸)的脂質過氧化損傷最為廣泛和嚴重,可致細胞結構的改變,完整性破壞;線粒體膜損傷可致能量代謝紊亂,呼吸鏈受損,氧化磷酸化脫偶聯;溶酶體膜受損可致溶酶體酶釋放。(2)自由基攻擊蛋白質可致蛋白質變性、降解、功能喪失。(3)自由基攻擊DNA分子,可引起DNA損傷,導致基因突變,使正常細胞轉化為增殖分化異常的癌細胞,參與誘導神經元凋亡,有實驗證實消除氧自由基可以減少培養的皮質神經元凋亡[7]。(4)自由基還可攻擊血管內皮細胞膜,加重血管源性腦水腫[8]。從本實驗中我們可以看出,缺血-再灌注組SOD含量在三個不同時間點較假手術組低,而M DA含量反而高于假手術組,表明自由基參與了缺血性腦損傷。

本實驗結果表明,β-七葉皂甙鈉治療組在不同時間點腦組織SOD含量增加,MDA含量下降,與缺血-再灌注組各時間點比較差異具有統計學意義;從病理形態改變上我們也可以看出,β-七葉皂甙鈉治療組的神經細胞壞死程度減輕,主要表現為輕度的細胞水腫,損傷程度明顯輕于缺血-再灌注組。神經功能損害評分也顯示,β-七葉皂甙鈉治療組明顯優于缺血-再灌組。這說明β-七葉皂甙鈉能抑制氧自由基的產生,使MDA含量下降,同時使腦組織SOD活性升高。Guillaume等[9]研究發現,歐馬栗提取物(horse chestnut extract,HCE,其中含70%的七葉皂甙)具有抗自由基作用,體外實驗發現,HCE呈劑量依賴性抑制酶性和非酶性引發的脂質過氧化;體內試驗證實,HCE能減輕氧自由基對細胞及其周圍組織的毒性作用。張奕等[10]通過對家兔腦皮質組織SOD活性和MDA濃度的測定,發現5 mg/kg的β-七葉皂甙鈉能夠提高腦組織SOD的活性、降低MDA含量。β-七葉皂甙鈉的神經保護作用機制之一可能是通過抗自由基途徑,以減輕自由基對腦細胞的不同結構的損傷,減輕腦水腫、細胞凋亡。

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[10] 張奕,付強,崔乃杰.β-七葉皂甙鈉對家兔腦缺血-再灌注損害的保護作用[J].急診醫學,1998,7(1):23-26.