食道癌中m iR-542-3p對Survivin基因的作用研究

蔡偉明 彭仕駿 呂文強 張志峰

（廣東省揭陽市人民醫院心胸外科，廣東揭陽 522000）

食道癌是世界上最常見的6大惡性腫瘤之一，在我國每年約有25萬新患者產生，其死亡率居惡性腫瘤的第4位。至今，已較成功的在分子水平上確認食道癌的致病基因，但如何對其進行基因治療仍是一大難題[1-2]。Survivin在人類各種腫瘤組織癌細胞中含量很豐富，但在正常細胞中卻幾乎不存在[3-4]。Survivin是一個142個氨基酸的蛋白，屬于一類防止細胞凋亡的蛋白質。

microRNAs（miRNAs）是一個長度為21～25個核苷酸非編碼的小RNA家族，人類基因組編碼了超過1000個miRNA，通過干擾mRNA的翻譯而下調靶基因的表達。生物信息學數據表明，miRNA幾乎參與體內所有的基本的信號傳導途徑，包括許多重要腫瘤相關基因的表達。研究表明，miRNA表達失調與腫瘤發生密切相關，并已成功利用miRNA對腫瘤進行診斷、分期與生物治療。在現有的基礎上，通過對Survivin基因潛在的miRNA進行預測，挑取評分較高的miR-542-3p進行研究[5-8]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

人食道癌細胞株KYSE-510由中國醫學科學院上海生命科學院贈送。細胞培養用RPMI1640培養基與胎牛血清（FBS）為PAA產品；脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產品；一步法RT-PCR擴增試劑盒和染料法定量試劑盒購自TaKaRa公司；miRNA mimics購自廣州銳博公司。

1.2 細胞培養

細胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中，于含10%胎牛血清、100U/m L青霉素、100mg/L鏈霉素的RPMI1640培養液中培養。待貼壁生長后，用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液消化，進行傳代培養。

1.3 細胞轉染

轉染前1天接種細胞于24孔板，第2天細胞匯合度達到75%時進行轉染，分為miR-542-3p過表達組（加入miRNA mimics）、正常對照組，每組重復3次，操作步驟按說明書進行，試劑用量按說明書的推薦用量而加。

1.4 染料法定量檢測Survivin基因的表達情況

轉染24h后，收集細胞提取RNA，染料法定量檢測Survivin基因的表達情況[9]，引物如下：F：5’-GGTTGTGAATGAGGCTTCTG-3’；R：5’-TGGCTTGCTGGTCTCTTC-3’，擴增長度為125bp。

內參為GAPDH：F：5’-TCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’；R：5’-ACTCCGACCTTCACCTTC-3’，擴增長度為97bp。

1.5 統計學處理

采用SPSS12.0軟件進行非參數一致性檢驗、秩和檢驗及x2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 Survivin的表達與m iR-542-3p的關系

2 結果

將miRNA mimics組中Survivin相對表達水平的平均值設為1，與對照組相比，轉入miRNA模擬物組的Survivin的表達顯著降低（P＜0.01）。顯示miR-542-3p對Survivin具有明顯的負調控作用。見圖1。

3 討論

Survivin是由142個氨基酸構成的蛋白，僅含有單一的BIR功能區，沒有環指結構。Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族中的新成員，在人類眾多惡性腫瘤中高表達，具有強烈的凋亡抑制功能和促細胞增殖活性，并與部分腫瘤的血管生成和預后有密切關系，因而已成為基因治療的熱門靶點。體內外研究表明，Survivin可在多種轉化細胞系中表達，并見于所有人類最常見的腫瘤組織，包括肺癌、結腸癌、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌。

miRNA在不同組織不同發育階段的持續保守性表達具有廣泛的調控功能。miRNA調控基因表達的功能與來源無關，因此miRNA已經成為重要的實驗工具。之前的研究表明食道癌細胞Survivin表達量會增多，在這一基礎上，為探討miRNA在腫瘤治療中的應用，本研究通過對靶向Survivin的miRNA進行研究，觀察其對Survivin的抑制作用。實驗證明miRNA能顯著抑制Survivin基因的表達，為其在腫瘤基因治療中的應用奠定了基礎。這一研究不僅加深了對食道癌分子機制的了解，而且說明Survivin可能會是治療食道癌潛在的靶點[10-13]。

[1] 鄒繼彬，黃廣恩，陳鴻蓮，等. 食管癌Survivin和PCNA的表達及其臨床意義[J]. 中國醫師雜志，2005，7（7）：898-900.

[2] 況麗平，吳名耀. 食管癌MGMT、survivin蛋白的表達及其臨床意義[J].腫瘤防治研究，2007，34（1）：21-23.

[3] 張德慶，孟光源，李毅，等. Survivin基因在食管癌組織中的表達及臨床意義[J]. 泰山醫學院學報，2006，27（2）：113-116.

[4] 劉劍波，王克文. 食管癌survivin mRNA的異常表達[J]. 南華大學學報（醫學版），2007，35（5）：735-737.

[5] Nehad M Alajez，Michelle Lenarduzzi，Emma Ito，et al. miR-218 suppresses nasopharyngeal cancer progression through downregulation of survivin and the SLIT2-ROBO1 pathway[J]. Cancer Res，2011，71（6）：2381-2391.

[6] 王海峰，茍欣，黎衍敏，等. C57BL小鼠survivin基因miRNA表達載體的構建[J]. 中國組織工程研究與臨床康復，2009，13（53）：10491-10494.

[7] 駱曉梅，劉家云，蘇明權，等. 靶向survivin的microRNA和siRNA抑制前列腺癌細胞survivin基因表達和凋亡作用的比較[J]. 第四軍醫大學學報，2009，30（4）：331-335.

[8] 駱曉梅，劉家云，蘇明權，等. Survivin靶向microRNA表達載體的構建和鑒定[J]. 中國腫瘤生物治療雜志，2007，14（2）：187-189.

[9] 何曉松，錢志英，何流，等. 實時熒光定量RT-PCR檢測食管癌survivin mRNA的表達[J]. 臨床和實驗醫學雜志，2006，5（1）：10-11.

[10] Yoon S，Choi YC，Lee S，et al. Induction of growth arrest by miR-542-3p that targets survivin[J]. FEBS Lett，2010，584（18）：4048-4052.

[11] 賀小停，曹秀峰. miRNA與食管癌[J]. 世界華人消化雜志，2007，15（19）：2133-2137.

[12] 程蕾，凌志強，毛偉敏. microRNA在食管癌中的特征[J]. 世界華人消化雜志，2010，18（23）：2434-2441.

[13] Yihua Wang，Hongxia Zhu，Lanping Quan，et al. Downregulation of survivin by RNAi inhibits the growth of esophageal carcinoma cells[J]. Cancer Biology&Therapy，2005，4（9）：974-978.