COCH基因與miR-96的相關(guān)性研究

許智華 劉海霞

（山西省兒童醫(yī)院耳鼻喉科，山西太原 030013）

COCH基因是人類發(fā)現(xiàn)的第1個伴前庭功能障礙的常染色體顯性遺傳非綜合征型耳聾基因，定位于14號染色體長臂14q12～13，在耳蝸和前庭組織中有高度表達，其編碼的Cochlin蛋白是內(nèi)耳細胞外基質(zhì)的主要成分。

COCH基因突變可致患者出現(xiàn)漸進性感音神經(jīng)性耳聾、前庭功能障礙癥狀，診斷為人類常染色體顯性遺傳非綜合征性耳聾疾病（Non-syndrom ic autosomal dom inant sensofineural deafness，DFNA）DFNA9[1]。

M icroRNAs（m iRNAs）是一種小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，大約由21～25個核苷酸組成。這些小的m iRNA通常靶向一個或者多個mRNA，通過翻譯水平的抑制或斷裂靶標mRNAs而調(diào)節(jié)基因的表達[2]。

謝菲爾德大學沃爾特·馬科蒂博士等通過對小白鼠的研究發(fā)現(xiàn)，m iR-96與哺乳動物耳蝸發(fā)育密切相關(guān)，m iR-96突變會導(dǎo)致人和小鼠漸進性失聰。研究人員認為，m iR-96會調(diào)節(jié)耳蝸毛細胞生理發(fā)育進程，也會影響耳蝸毛細胞的形態(tài)，對哺乳動物的聽覺系統(tǒng)至關(guān)重要[3-5]。根據(jù)目前的研究基礎(chǔ)，筆者通過熒光定量PCR來檢測m iR-96是否會調(diào)節(jié)COCH基因的表達情況，或者兩者之間存在某種關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

B95-8 （絨猴EBV 轉(zhuǎn)化的白細胞）購自上海中科院細胞庫；RPM I1640培養(yǎng)基與胎牛血清（FBS）為PAA產(chǎn)品；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectam ineTM 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品；一步法RT-PCR擴增試劑盒購自美國Promega公司；m iRNA m im ics和m iRNA inhibitor購自廣州銳博公司。

1.2 永生細胞系的建立

參照趙蘇瑛等[6]的凍存白細胞法進行建系。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前1天接種細胞于24孔板，第2天細胞匯合度達到75%時進行轉(zhuǎn)染，分組情況如下：m iR-96過表達組（加入m iRNA m im ics）、正常對照組、m iR-96低表達組（加入m iRNA inhibitor），每組重復(fù)3次，操作步驟按說明書進行，試劑用量按說明書的推薦用量而加。

1.4 染料法定量檢測COCH基因的表達情況

轉(zhuǎn)染24h后，收集細胞提取RNA，染料法定量檢測COCH基因的表達情況。COCH基因引物如下：

F：5'-CTTCACGGTAGATGCTGGAGTAAG-3'；

R：5'-GCCACAATGCCTGCTTCCTC-3'，擴增長度為102bp。

內(nèi)參為GAPDH：F：5'-TCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'；R：5'-ACTCCGACCTTCACCTTC-3'，擴增長度為97bp。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS12.0軟件進行非參數(shù)一致性檢驗、秩和檢驗及χ2檢驗，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

圖1 COCH的表達與m iR-96的關(guān)系

將m iRNA inhibitor組中COCH的相對表達水平的平均值設(shè)為1，與對照組相比，轉(zhuǎn)入m iRNA抑制劑組的COCH的表達顯著降低（P ＜0.05）；轉(zhuǎn)入m iRNA模擬物組的COCH表達顯著增高（P ＜ 0.05）。這與通常的m iRNA呈負調(diào)控的機理相反，而表現(xiàn)出協(xié)同關(guān)系。見圖1。

3 討論

COCH基因是人類發(fā)現(xiàn)的第1個伴前庭功能障礙的常染色體顯性遺傳非綜合征性耳聾基因，在耳蝸和前庭組織中有高度表達，其編碼的Cochlin蛋白是內(nèi)耳細胞外基質(zhì)的主要成分。COCH基因突變可致患者出現(xiàn)漸進性感音神經(jīng)性耳聾、前庭功能障礙癥狀，診斷為DFNA9。DFNA9家系表現(xiàn)為遲發(fā)性、進行性聽力下降，在不同的家系中耳聾的發(fā)生年齡從十幾歲至四五十歲不等，患者在耳聾發(fā)生時即伴有走路不穩(wěn)（尤其是在夜間）和頭部運動時出現(xiàn)幻視等前庭功能障礙表現(xiàn)，耳聾的外顯率幾乎為100%。總之，COCH基因作為一個在前庭、耳蝸均有表達的基因，對于耳蝸及前庭功能變化起著至關(guān)重要的作用，但COCH基因及其編碼的Cochlin蛋白的功能、致病機制尚不完全清楚[7]。

而最近的研究發(fā)現(xiàn)，m iR-96與哺乳動物耳蝸發(fā)育密切相關(guān)，m iR-96突變會導(dǎo)致人和小鼠漸進性失聰。研究表明，通常m iR-96會在特定階段影響許多與發(fā)育相關(guān)的不同基因表達，進而調(diào)節(jié)毛細胞的生長過程。一旦小鼠體內(nèi)m iR-96基因中某一區(qū)域的單個堿基對突變，就會導(dǎo)致小鼠眾多的基因表達的改變。研究論文指出，m iR-96發(fā)生突變，使得小鼠在出生后，其內(nèi)耳和外耳毛細胞出現(xiàn)生物物理變異之前，感覺毛細胞的生理發(fā)育即已受到影響。

此外，m iR-96突變后，毛細胞靜纖毛束的發(fā)育和耳蝸內(nèi)聽覺神經(jīng)聯(lián)系的構(gòu)建都會受到影響，這不僅會影響毛細胞的敏銳程度，還會影響感覺神經(jīng)的電信號傳遞。據(jù)此，研究人員認為，m iR-96會調(diào)節(jié)耳蝸毛細胞生理發(fā)育進程，也會影響耳蝸毛細胞的形態(tài)，對哺乳動物的聽覺系統(tǒng)至關(guān)重要[8-10]。

基于COCH基因和m iR-96發(fā)生突變后均會引起相似的病癥，筆者試圖探討這兩者之間是否存在某種關(guān)聯(lián)。而本實驗的數(shù)據(jù)說明m iR-96并沒有對COCH基因進行負調(diào)控，而是出現(xiàn)協(xié)同現(xiàn)象。這有可能是m iR-96通過調(diào)控其他相關(guān)因子而促進了COCH基因的表達，從而在動物耳蝸發(fā)育中表現(xiàn)出協(xié)同作用。現(xiàn)有資料表明很多人包括一些新生兒和小孩會受到漸進性失聰?shù)挠绊懀茖W家對于漸進性失聰?shù)倪z傳因素了解甚少。隨著人們對COCH基因及其編碼的Cochlin蛋白功能的深入研究，COCH基因及其編碼的Cochlin蛋白功能與DFNA9疾病的相互關(guān)系將得到進一步闡明。而同時，m iR-96發(fā)生變異可導(dǎo)致漸進性失聰?shù)姆肿訖C制的發(fā)現(xiàn)，可為未來該疾病的治療提供新的分子標靶，為改善聽力損失和失聰?shù)闹委熓侄蔚於嘶A(chǔ)。

[1]陳金霞，張桂茹，張明輝.COCH 基因與DFNA9的相關(guān)性研究[J].吉林醫(yī)學，2007，28（2）：169-171.

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[3]Stephanie Kuhna， Stuart L. Johnsona， David N. Furnessb， et al. m iR-96 regulates the progression of differentiation in mammalian cochlear inner and outer hair cells[J].PNAS，2011，108（6）：2355-2360.

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[5]Lew is MA. An ENU-induced mutation of miR-96 associated with progressive hearing loss in m ice[J].Nat Genet，2009，41（5）：614-618.

[6]趙蘇瑛，張海軍，徐春宏，等. 非綜合征耳聾大家系永生細胞系的建立及幾種EB病毒轉(zhuǎn)化外周血淋巴細胞建系方法的探討[J].遺傳，2005，27（3）：447-450.

[7]孫悍軍，陶然，程靜，等. 常染色體顯性遺傳非綜合征型耳聾致病基因定位研究[J].遺傳，2006，28（12）：1489-1494.

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