水葫蘆沼液對青菜生長及AsA-GSH循環影響的動態研究

薛延豐,馮慧芳,石志琦,嚴少華 ,鄭建初

(1.江蘇省農業科學院食品質量安全檢測研究所,江蘇南京 210094;2.江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地,江蘇 南京 210094;3.農業部食品安全監控重點開放實驗室,江蘇 南京210094;4.南京師范大學生命科學學院,江蘇 南京210097;5.江蘇省農業科學院農業資源與環境研究所,江蘇 南京210014)

水葫蘆(Eichhornia crassipes)學名鳳眼蓮,原產于南美洲,屬雨久花科,因在每個葉柄中部都有一個膨大似葫蘆的球狀體而得名。具有發達的水下根系。水葫蘆喜歡高溫濕潤,水葫蘆龐大的根須不斷地吸收水中的污染物,其驚人的繁殖速度造就了超強的凈化水質的本領。水葫蘆的資源化利用成了人們關注的熱點,通常水葫蘆可以直接燃燒提供能源(熱能或電能)、也可作為飼料直接利用,或者發酵后作為有機肥進行利用,研究發現,水葫蘆體內富含氮磷鉀,其中含N 6.56%,P 0.84%,K 12.32%,Ca 4.58%,Mg 1.58%,Fe 0.671%,Mn 0.446%,C/N接近15,水葫蘆發酵液幾乎含有植物生長的所有營養元素[1]。還有研究發現,水葫蘆發酵液具有促進作物生長、抗病蟲害等功效,利用生物質厭氧發酵形成的發酵液被譽為是一種優質的有機肥料和廣譜性的生物農藥,其商品化價值巨大[2]。那么水葫蘆發酵后的沼液如何進行合理利用,還沒有得到更多的研究。通過本實驗室前期研究水葫蘆沼液對青菜(Brassica rapa)種子浸種后對種子發芽參數和生理參數的影響,發現水葫蘆沼液可以提高其發芽指數、活力指數、生物量以及葉綠素含量[3],為進一步研究在青菜整個生長周期內水葫蘆沼液對其生長及AsA-GSH代謝循環的影響,故本試驗選取青菜為研究對象,使用不同比例水葫蘆沼液對青菜進行處理,分別于不同處理時間進行采樣,研究其生長及AsA-GSH代謝循環中相關參數的變化,并對其進行分析,以期進一步為水葫蘆沼液浸種的可實用性提供更為全面的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料和處理

供試蔬菜:青菜(綠領矮抗1號);供試沼液取自江蘇省農業科學院水葫蘆發酵后產生的沼液,其中pH值為7.06,全N、全P、全K含量分別為0.75 g/kg,0.22 g/kg,0.15 g/kg。該試驗在江蘇省農業科學院培苗室進行,時間為2009年5-9月。

青菜種子用0.3%的H2O2消毒后,用蒸餾水洗凈,然后挑選均一、形態正常的種子置于鋪3層濾紙的培養皿(直徑15 cm)中,進行培苗,晝夜平均溫度分別為31和22℃。當幼苗長到5 cm左右時,選取長勢一致的材料將其轉移至塑料盆缽中,苗齡20 d后,分別用不同處理液進行澆灌,每個處理重復3次。處理液每隔5 d澆灌一次,分別于處理15,30,45,60 d后進行采樣,測定各處理青菜相關生理生化指標。

具體處理如下:對照(CK)、25%沼液+75%化肥(Z-25%)、50%沼液+50%化肥(Z-50%)、75%沼液+25%化肥(Z-75%)、100%沼液(Z-100%)。所用化肥采用江蘇省農業科學院蔬菜所提供的水溶性肥料,內含全氮30%,其中銨態氮(NH4-N)2.42%、硝態氮(NO3-N)3.32%,水溶性磷(P2O5)10%,水溶性鉀(K2O)10%,水溶性鎂(MgO)0.20%及微量元素等;水葫蘆的折算方法是用水葫蘆沼液干物質量按比例來替代化肥。

1.2 測定方法

1.2.1 鮮重測定 試驗結束后,于采樣當天的7:00-8:00,每盆隨機挑取6棵生長狀況較一致的幼苗,然后用去離子水洗凈吸干后測量其鮮重[4,5]。

1.2.2 抗壞血酸含量測定 還原型抗壞血酸(ascorbate,AsA)、脫氫抗壞血酸(dehydroascorbate,DHA)和總Vc含量參照Zhang和Kirkham[6]的方法測定。稱取1 g青菜葉片在4℃下于5%的偏磷酸中研磨成勻漿,然后于4℃下12 000 r/min離心15 min,收集上清液用于測定總Vc和AsA的含量。測定總Vc時,取0.3 mL上清液,加入0.75 mL含5 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetie acid,EDTA)的磷酸緩沖液(150 mmol/L,pH 7.4)和0.15 mL 10 mmol/L的二硫蘇糖醇(DiThioThreitol,DT T)。室溫下放置10 min后,加入0.15 mL 0.5%N-乙基馬來酰亞胺以消除多余的DT T。然后加入 0.6 mL的10%三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、0.6 mL的44%正磷酸溶液、0.6 mL的4%雙吡啶酒精(70%)溶液和 0.15 mL的0.3%(w/v)FeCl3溶液。混勻后40℃水浴40 min,測525 nm處的吸光值。AsA的測定過程中以0.3 mL水代替DT T和N-乙基馬來酰亞胺,其余操作步驟如上所述。DHA為總Vc與AsA的差值[7]。

1.2.3 谷胱甘肽含量的測定 氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)含量和還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)含量測定參照樊懷福等[8]的方法。

1.2.4 谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)測定 提取GR酶液:取0.5 g青菜,加入5 mL 50 mmol/L的T ris-HCl(pH 7.0),內含 20%(v/v)甘油、1 mmol/L 抗壞血酸 、1 mmol/L DT T 、1 mmol/L EDTA 、1 mmol/L GSH 及5 mmol/L MgCl2,在冰上研磨后,提取液在 4℃下、10 000 r/min離心30 min,上清液用于測定酶活性[9]。GR的測定參照郭麗紅等[9]和吳錦程等[10]的方法,這是基于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化后在340 nm處的吸光度減少來衡量酶活性大小的方法。反應液包括50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液、5 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L GSSG 和0.2 mmol/L NADPH,終體積為1.2 mL。在25℃下,加入GSSG啟動反應。

1.2.5 抗壞血酸-谷胱甘肽循環相關酶活性的測定 抗壞血酸氧化酶(ascorbate oxidase,AAO)活性參照吳錦程等[10,11]的方法測定。取2 g葉片,加10 mL預冷的50 mmol/L磷酸緩沖液[pH 7.0,含1 mmol/L抗壞血酸,1 mmol/L EDTA、2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.25%T ritonX-100]研磨,于4℃下8 000 r/min離心20 min,上清液即為酶液。取上清液0.12 mL,加入3 mL含2.88 mL磷酸緩沖液(pH 7.0,0.5 mmol/L抗壞血酸)的反應液,以不加酶液為對照,記錄OD290變化[10]。抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)、脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase DHAR)和單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbate reductase,MDHAR)的活性測定參照吳錦程等[10,11]的方法進行,粗酶液提取方法同上,以每min內吸光值變化0.01為一個酶活性單位(U)。

1.3 統計分析

運用EXCEL和SPSS生物統計軟件進行相關數據分析。

2 結果與分析

2.1 沼液對青菜生長的影響

在不同比例沼液處理下,青菜的株高和生物量隨著處理時間的不同而不同(表1)。就株高而言,Z-25%處理下,15,30,45和60 d時,株高分別比對照增加了6.6%,6.0%,11.2%和10.5%,均顯著大于對照;在Z-50%處理下,15 d時比對照小0.5%,但與對照差異不顯著,30 d時比對照增加了3.0%,與對照差異不顯著。隨著處理時間的增加,株高與對照相比顯著增加,45和60 d時的株高分別比對照增加了6.8%和9.9%;在Z-75%處理下,15,30,45和60 d時株高分別比對照減少了10.8%,17.6%,18.3%和9.9%,均顯著小于對照;隨著沼液使用比例的增加,株高生長受到嚴重影響,在Z-100%處理下,株高的變化趨勢與Z-75%處理相同,隨著處理時間的增加,株高與對照相比顯著降低。

生物量的變化趨勢與株高不同。在Z-25%處理下,15 d時鮮重增加的最多,比對照增加了22.9%,顯著大于對照,30,45和60 d時鮮重分別比對照增加了7.6%,8.7%和9.3%,均顯著大于對照;在Z-50%處理下,15 d時比對照小1.5%,但與對照差異不顯著,30和45 d時鮮重分別比對照增加了1.0%和3.3%,60 d時比對照小14.8%,顯著小于對照;在Z-75%處理下,隨著處理時間的增加,鮮重降低的幅度越大,15,30,45和60 d時鮮重分別比對照減少了18.3%,27.3%,29.7%和42.6%,均顯著小于對照;在Z-100%處理下,鮮重的變化趨勢與Z-75%處理相同。說明用適量的水葫蘆沼液對青菜進行處理,有助于植株的生長。

表1 不同比例沼液處理對青菜生長及生物量的影響Table 1 Effects of different biogas slurry ratio on the growth and biomass in B.rapa

2.2 沼液對青菜體內抗壞血酸含量的影響

總量Vc、AsA和DHA變化趨勢不相同(表2)。對于總量Vc而言,Z-25%處理下,15和30 d時青菜體內總量Vc分別比對照增加了4.7%和5.0%,但與對照相比差異不顯著,隨著處理時間的增加,在45和60 d時,青菜體內總量Vc分別比對照增加了5.2%和12.4%,顯著大于對照;在Z-50%處理下,15 d時比對照小7.5%,顯著小于對照,30,45和60 d時分別比對照增加了1.9%,2.1%和5.7%,但與對照差異不顯著;在Z-75%處理下,15,30,45和60 d時青菜體內總量Vc分別比對照減少了24.7%,20.1%,21.1%和16.1%,均顯著小于對照;在Z-100%處理下,總量Vc的變化趨勢與Z-75%處理相似,隨著處理時間的增加,總量Vc與對照相比顯著降低。

在Z-25%處理下,除了30 d時青菜體內AsA含量顯著大于對照,處理15,45和60 d時青菜體內AsA含量雖然與對照相比有所增加,但差異不顯著;在Z-50%處理下,15和30 d時青菜體內AsA含量分別比對照小11.4%和3.0%,與對照差異顯著,處理45和60 d時AsA含量分別比對照小4.5%和4.8%,但差異不顯著;Z-75%處理下,青菜體內AsA含量的變化趨勢與Z-50%處理相似;在Z-100%處理下,15,30,45和60 d時青菜體內AsA含量分別比對照減少了61.2%,32.1%,38.1%和34.6%,均顯著小于對照。

DHA含量的變化趨勢與總量Vc和AsA含量的變化趨勢各不相同。在Z-25%處理下,處理15,30,45和60 d時,青菜體內DHA含量分別比對照增加了5.5%,4.2%,5.5%和17.1%,均顯著大于對照;Z-50%處理下青菜體內DHA含量的變化趨勢與Z-25%處理相似;在Z-75%處理下,處理15 d時青菜體內DHA含量比對照小7.6%,但與對照差異不顯著,隨著處理時間的增加,在30,45和60 d時分別比對照小29.8%,27.2%和22.6%,差異顯著;在Z-100%處理下,青菜體內的DHA含量均顯著小于對照。

表2 不同比例沼液處理對青菜體內抗壞血酸含量的影響Table 2 Effects of different biogas slurry ratio on the ascorbate content of B.rapa

2.3 沼液對青菜幼苗葉片抗壞血酸循環中酶活性的影響

Z-25%處理下,APX酶活性隨著處理時間增加呈先增加后降低的趨勢(圖1),處理15 d時,青菜體內APX酶活性比對照高11.9%,顯著大于對照,30,45和60 d時,APX酶活性分別比對照高64.9%,44.5%和44.4%;在Z-50%處理下,處理15 d時,APX酶活性比對照小20.4%,顯著小于對照,處理30和45 d時,APX酶活性分別比對照高8.9%和1.8%,60 d時,比對照小4.5%,但30,45和60 d時的APX酶活性與對照差異均不顯著;在Z-75%處理下,除了處理30 d時,APX酶活性比對照高2.6%,15,45和60 d時,青菜體內APX酶活性分別比對照減少了23.0%,19.5%和18.6%,差異顯著;在Z-100%處理下,青菜體內APX酶活性隨著處理時間的增加,與對照相比均顯著降低。

AAO酶活性的變化趨勢與APX酶活性的變化趨勢不同(圖1)。在Z-25%處理下,處理15,30,45和60 d時,體內AAO酶活性分別比對照高4.8%,5.9%,3.7%和7.2%,差異均不顯著;在Z-50%處理下,隨著處理時間的增加,AAO酶活性比對照的降低幅度增加,處理15,30,45和60 d時體內AAO酶活性分別比對照低10.3%,22.0%,22.1%和24.7%,差異顯著;Z-75%和Z-100%處理下,青菜體內AAO酶活性的變化趨勢與Z-50%處理相似。

在Z-25%處理下,處理15 d時,DHAR酶活性比對照高0.7%,差異不顯著,隨著處理時間的增加,DHAR酶活性顯著增加,分別比對照高14.8%,18.5%和33.7%;在Z-50%處理下,處理15 d時DHAR酶活性比對照小24.7%,顯著小于對照,處理30,45和60 d時的DHAR酶活性分別比對照小9.7%,3.7%和2.2%,但差異不顯著;在Z-75%處理下,隨著處理時間的增加,DHAR酶活性顯著降低,但降低幅度減少,處理15,30,45和60 d時,體內DHAR酶活性分別比對照降低了57.0%,41.8%,34.1%和26.7%;Z-100%處理下青菜體內DHAR酶活性的變化趨勢與Z-75%處理下相似(圖1)。

在Z-25%處理下,處理15 d時,MDHAR酶活性比對照小7.2%,但差異不顯著,處理30和45 d時,MDHAR酶活性分別比對照高6.2%和9.1%,差異不顯著,60 d時的MDHAR酶活性顯著大于對照;在Z-50%處理下,隨著處理時間的增加,MDHAR酶活性顯著降低,15,30,45和60 d時的MDHAR酶活性分別比對照小23.6%,30.3%,23.9%和27.5%;Z-75%和Z-100%處理下,青菜體內MDHAR酶活性的變化趨勢與Z-50%處理相似(圖1)。

圖1 不同比例沼液處理對青菜體內APX、AAO、DHAR和MDHAR的影響Fig.1 Effects of different biogas slurry ratio on the activities of APX,AAO,DHAR and MDHAR in B.rapa

2.4 沼液對青菜幼苗葉片谷胱甘肽循環的影響

在Z-25%處理下,GSSG含量隨著處理時間增加而增加(圖2),處理15,30,45和60 d時,GSSG含量分別比對照增加13.5%,13.6%,12.2%和10.6%,且差異顯著;在Z-50%處理下,處理15,30和45 d時,GSSG含量分別比對照小6.0%,7.7%和7.4%,差異不顯著,處理60 d時,GSSG含量與對照相比顯著降低;在Z-75%處理下,處理15 d時,GSSG含量比對照小8.2%,差異不顯著,處理30,45和60 d時,GSSG含量分別比對照減少11.9%,13.9%和14.0%,差異顯著;在Z-100%處理下,處理15,30,45和60 d時,GSSG含量分別比對照小15.6%,20.0%,22.1%和21.6%,且差異顯著。

在Z-25%處理下,處理15,30,45和60 d時,GSH含量分別比對照高5.8%,2.0%,2.1%和2.1%,但差異不顯著;在Z-50%處理下,處理15,30,45和60 d時,GSH含量分別比對照小13.0%,17.5%,17.1%和17.6%,差異顯著;Z-75%和Z-100%處理下,青菜體內GSH含量的變化趨勢與Z-50%處理相似,隨著處理時間的增加GSG含量顯著降低(圖2)。

圖2 不同比例沼液處理對青菜體內GSSG和GSH含量及GR活性的影響Fig.2 Effects of different biogas slurry ratio on GSSG content,GSH content and GR of B.rapa

GR酶活性的變化與GSSG含量和GSH含量變化趨勢不同。在Z-25%處理下,處理15和30 d時,GR酶活性分別比對照高5.4%和4.9%,與對照差異不顯著,45 d時,GR酶活性比對照高26.3%,顯著大于對照,60 d時的GR酶活性與對照相同(圖2);在Z-50%處理下,15,30和 45 d時,GR酶活性分別比對照小12.4%,10.3%和16.7%,差異不顯著,60 d時的GR酶活性雖然有所降低,但與對照差異不顯著;在Z-75%處理下,15,30,45和60 d時,GR酶活性分別比對照小32.6%,32.0%,8.5%和16.1%,差異顯著;Z-100%處理下GR酶活性的變化趨勢與Z-75%處理相似。

3 討論

作物的正常生長需要外部提供營養,本試驗結果表明,使用不同比例沼液代替化肥對青菜的株高及生物量產生不同的影響,其中以25%沼液替代化肥的處理效果最好,在不同的采樣時期,其株高和生物量均顯著大于對照,當沼液使用比例大于50%時,株高和生物量均隨著沼液使用比例的增加而降低,與對照差異顯著。沼液能促進青菜產量提高,是因為沼液中含有豐富的營養物質和生物活性物質[12],這些活性物質易于被作物吸收,向作物提供營養。同時這些物質還可以促進植物根系發育,增加植株對營養的吸收,促進植株的生長,同時增加植物的抗病能力,提高產量[13,14],根系活力泛指根系整個代謝的強弱,包括吸收、合成、呼吸作用和氧化力等,能客觀地反映根系生命活動,根系活力的大小與整個植株生命活動的強度緊密相關[15]。而高量沼液處理使得其生長和產量降低。這些與前人研究結果相同[16-18]。

在正常情況下,植物體內清除活性氧的酶類活性較強,可及時清除植物受環境脅迫時產生的過量活性氧,從而使活性氧的產生和清除保持一種動態平衡[4,19]。AsA、DHA、APX、AAO、DHAR、MDHAR和GSSG、GSH、GR組成了AsA-GSH循環,其中APX、MDHAR、DHAR和GR是AsA-GSH循環活性氧清除系統的重要酶組成,AsA和GSH等是重要的非酶抗氧化物質。在AsA-GSH循環中,GSH,AsA和MDHAR、DHAR,APX,AAO和GR等組成植物葉綠體 AsA-GSH循環中的抗氧化防御系統,在清除活性氧方面起重要作用[10,20]。其中,APX和AAO是植物的2種抗壞血酸氧化酶,MDHAR和DHAR在抗壞血酸-谷胱甘肽循環中AsA的再生起到了很重要的作用,是植物的2種抗壞血酸還原酶[21]。試驗結果表明,用25%沼液替代化肥處理下的45和60 d,總量Vc與對照相比顯著增加,AsA雖然有所增加(除了30 d時),但與對照差異不顯著,DHA含量均顯著大于對照,當沼液使用比例大于50%時,總量Vc、AsA和DHA與對照相比均顯著降低;在AsA循環中的APX、AAO和DHAR活性變化趨勢相似,均隨著處理時間增加呈先增加后降低的趨勢,其中以25%沼液替代化肥處理下30 d酶活性最高,而MDHAR活性則隨著處理時間的增加而增加,以25%沼液替代化肥的處理效果最好;在GSH循環中的GSSG和GSH含量隨著處理時間的增加而增加,以25%沼液替代化肥的處理效果最好,與對照差異顯著,而GR活性隨著處理時間增加呈先增加后降低的趨勢,其中以25%沼液替代化肥處理下45 d酶活性最高。本試驗結果發現,在25%沼液處理下,可有效增加AsA-GSH循環中相關酶活性和相關物質含量,從而促進了AsA-GSH循環,間接地增加了青菜體內Vc含量,改善了青菜的品質,這與Jin等[22]的研究結果一致。

通過本試驗結果,同時結合前期研究[3],發現適宜濃度的水葫蘆沼液浸種不僅可以促進種子發芽,提高發芽指數、活力指數、生物量以及葉綠素含量,而且適宜比例的水葫蘆沼液處理,還可以促進植株的生長,增加了體內AsA-GSH代謝循環,提高了青菜的抗氧化防御能力。

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