G-CSF對(duì)于血管性癡呆大鼠保護(hù)作用的研究

楊 靜，王 維，沈恩旭，馬興麗，王朋明

(天津市西青醫(yī)院，天津300380)

血管性癡呆(VD)是癡呆中最為常見的類型之一，血管性癡呆是一種隱匿發(fā)病的、逐漸進(jìn)展的記憶及認(rèn)知障礙的疾病，僅僅次于阿爾茲海默病(AD)。血管性癡呆是由于慢性腦供血不足所致，當(dāng)大腦血流及營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)被阻斷數(shù)分鐘，腦細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)壞死，從而導(dǎo)致腦皮層的損傷，繼而引起學(xué)習(xí)、記憶及語(yǔ)言的障礙。根據(jù)個(gè)人情況不同，以及中風(fēng)的嚴(yán)重程度的不同，血管性癡呆可以逐漸發(fā)生，也可以突然發(fā)生。

到目前為止還沒有FDA批準(zhǔn)的用于治療血管性癡呆的藥物。對(duì)于血管性癡呆的神經(jīng)干細(xì)胞治療受到高度關(guān)注。干細(xì)胞的研究是一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域。因?yàn)楦杉?xì)胞可以分化為神經(jīng)元從而修復(fù)腦損傷［1］。本文采用集落細(xì)胞刺激因子(G-CSF)治療VD模型大鼠，研究其對(duì)VD大鼠認(rèn)知功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠:本實(shí)驗(yàn)用成年雄性健康Wistar大鼠。體重200～250 g，購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組:將20只Wistar只大鼠隨機(jī)分為兩組，雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎(VD)組，VD集落細(xì)胞刺激因子治療組(VD+GSF)，每組10只大鼠。

1.3 VD大鼠模型制作:采用持久性雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法(2VO)建立血管性癡呆的老年大鼠模型。10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，頸部皮膚剃毛備皮，碘伏消毒后沿頸部中線切開約1.5 cm的皮膚切口，找到并游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，同時(shí)結(jié)扎。70%酒精消毒后縫合傷口，大鼠放回籠中飼養(yǎng)。

1.4 藥物給予:VD治療組給予G-CSF干預(yù)，具體過程為術(shù)后2 h給予G-CSF 200 ug/kg皮下注射，之后每d 1次，共5 d。

1.5 Morris水迷宮(MWM)測(cè)試。

1.6 抗Nestin免疫組織化學(xué)染色:兔抗大鼠一抗(抗nestin抗體，1∶100)、二抗均購(gòu)于武漢博士德。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:三組間比較采用SPSS 16.0軟件，單因素方差分析及選擇多重比較分析。有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義設(shè)在P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 VD模型大鼠認(rèn)知功能的改善:Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，VD模型大鼠給予集落細(xì)胞刺激因子治療后，與模型組大鼠相比，VD治療組大鼠的逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05，圖1)，而游泳速度并沒有改變(P＞0.05)。在第六天的測(cè)試階段，VD治療組大鼠的目標(biāo)象限百分比明顯高于VD模型組大鼠(P＜0.05，圖2)。而游泳速度在兩組組間并無明顯差異(P＞0.05)。

圖1 Morris水迷宮定位巡航實(shí)驗(yàn)

VD治療組大鼠的逃避潛伏期明顯低于VD模型組大鼠，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

VD治療組大鼠的目標(biāo)象限百分比較VD模型組大鼠增加，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 Nestin免疫組織化學(xué)染色:我們使用Nestin抗體觀察了大鼠海馬齒狀回區(qū)Nestin的表達(dá)情況。兩組大鼠的齒狀回區(qū)的顆粒細(xì)胞都有Nestin陽(yáng)性表達(dá)，分布于胞體中。VD治療組大鼠Nestin陽(yáng)性表達(dá)多余VD大鼠的陽(yáng)性表達(dá)。

圖2 Morris水迷宮空間搜索實(shí)驗(yàn)

3 討論

水迷宮實(shí)驗(yàn)表明，三組大鼠無論在定位航行階段還是在空間探索階段游泳速度都沒有顯著性差異，因此可以得出用該方法建立的VD動(dòng)物模型，沒有明顯的運(yùn)動(dòng)障礙，有利于長(zhǎng)時(shí)間觀察和研究。不論在學(xué)習(xí)階段還是在記憶維持階段，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有明顯下降。血管性癡呆是由于慢性腦供血不足所致，常常由中風(fēng)或者腔隙性梗塞所致［2］。血管性癡呆是一種隱匿發(fā)病的，逐漸進(jìn)展的記憶及認(rèn)知障礙的疾病。根據(jù)個(gè)人情況不同，以及中風(fēng)的嚴(yán)重程度的不同，血管性癡呆可以逐漸發(fā)生，也可以突然發(fā)生。對(duì)于血管性癡呆的治療以預(yù)防為主，以及擴(kuò)血管，血管內(nèi)膜旋切等改善血管供血的對(duì)癥治療。到目前為止還沒有確切的用于治療血管性癡呆的藥物。

粒集落細(xì)胞刺激因子(G-CSF)是一種造血生長(zhǎng)因子，是一種分子量為19.6 kDa的糖蛋白，G-CSF和其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)都有表達(dá)，在中風(fēng)的動(dòng)物模型中表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用。目前被認(rèn)為是一種有希望的治療急性中風(fēng)的藥物。VD常常由中風(fēng)或者腔隙性梗塞所致，因此本研究觀察了其對(duì)于VD的保護(hù)作用。研究表明，VD大鼠和假手術(shù)組大鼠相比，認(rèn)知功能下降，當(dāng)給予集落細(xì)胞刺激因子治療后，與未給予治療的VD組大鼠相比，認(rèn)知功能得到明顯改善。這說明粒集落細(xì)胞刺激因子參與了損傷腦組織的修復(fù)過程或替代了壞死神經(jīng)細(xì)胞的功能。

對(duì)于血管性癡呆的神經(jīng)干細(xì)胞治療受到高度關(guān)注。G-CSF的神經(jīng)保護(hù)作用與其促進(jìn)成人神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化有關(guān)［3］。對(duì)于干細(xì)胞的研究是一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域。因?yàn)楦杉?xì)胞可以分化為神經(jīng)元從而修復(fù)腦損傷。因而改善腦功能提高認(rèn)知水平在成年大鼠的腦區(qū)有三個(gè)部位干細(xì)胞存在，即腦室周圍、嗅球以及海馬齒狀回［4］。本研究觀察了給予集落細(xì)胞刺激因子治療VD后的Nestin的表達(dá)情況。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)明在VD治療組大鼠的齒狀回區(qū)Nestin的表達(dá)多于VD模型組大鼠。Nestin是一種中間絲蛋白，是未分化的神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志［5］，Nestin的高表達(dá)標(biāo)明集落細(xì)胞刺激因子可能通過增加神經(jīng)干細(xì)胞的動(dòng)員，分化為神經(jīng)元從而發(fā)揮損傷腦組織的修復(fù)過程或替代了壞死神經(jīng)細(xì)胞的功能。

集落細(xì)胞刺激因子是一種臨床使用安全的藥物，本實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用，并且可能與干細(xì)胞的動(dòng)員有關(guān)，本研究為其臨床使用提供了良好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ Kalladka D，Muir KW.Stem cell therapy in stroke:Designing clinical trials.Neurochem Int，2011.

［2］ Sharp SI，Aarsland D，Day S，et al.Hypertension is a potential risk factor for vascular dementia:systematic review［J］.Int J Geriatr Psychiatry，2011，26(7):661-669.

［3］ Schneider A，Kuhn HG，Schabitz WR.A role for G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor)in the central nervous system［J］.Cell Cycle，2005，4(12):1753-1757.

［4］ Scharfman HE，Hen R.Neuroscience.Is moreneurogenesis always better?Science，2007，315(5810):336-338.

［5］ Wurdak H，Zhu S，Min KH，et al.A small molecule accelerates neuronal differentiation in the adult rat［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(38):16542-16547.