木瓜蛋白酶水解大豆濃縮蛋白及糖基化修飾對水解產物溶解性的影響

張琳靜，于國萍*

(東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

木瓜蛋白酶水解大豆濃縮蛋白及糖基化修飾對水解產物溶解性的影響

張琳靜，于國萍*

(東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

為提高大豆濃縮蛋白(soy protein concentrate，SPC)在等電點處的溶解性，采用木瓜蛋白酶對大豆濃縮蛋白進行酶解，形成可溶性大豆蛋白，然后將其與葡聚糖進行糖基化反應，形成親水的蛋白質-多糖復合物。結果表明：大豆濃縮蛋白酶解最佳條件為大豆蛋白與水質量配比5∶100、酶添加量10000U/g、反應溫度55～60℃；糖基化最佳條件為葡聚糖與蛋白配比1∶1、反應時間3.5h；大豆濃縮蛋白在等電點附近(pH4)的氮溶指數由原來的9.53%提高到39.12%。本實驗制備的等電點可溶大豆蛋白，可增加其在中等酸度食品中的應用。

大豆濃縮蛋白；木瓜蛋白酶；糖基化；溶解性

大豆蛋白制品主要有3種——脫脂大豆粉、大豆濃縮蛋白(soy protein concentrate，SPC)、大豆分離蛋白。大豆蛋白在其等電點兩側溶解度較高，但是等電點附近溶解度最低，這一定程度上影響了大豆蛋白的凝膠性、乳化性、持水性等功能性質。特別是大豆濃縮蛋白在制備過程中受熱變性或醇變性，導致其溶解性更差。通常采用物理、化學和生物學方法，使大豆蛋白氨基酸殘基和多肽鏈發生變化，以提高其溶解性[1]。Jambrak等[2]利用超聲波處理大豆蛋白，經20kHz處理后，大豆分離蛋白和大豆濃縮蛋白的溶解性都有顯著提高。Tang等[3]發現超高壓尤其是400、600MPa處理大豆分離蛋白，可以使不溶的聚集物轉化成可溶的聚集物。酶解是大豆蛋白增溶改性常用的生物學方法，經蛋白酶水解后的大豆蛋白溶解性顯著改善：Lamsal等[4]發現大豆濃縮蛋白經限制性酶解后溶解性提高，在等電點附近溶解度提高了接近20%；使用Alcalase作為改性大豆蛋白的酶制劑，可以使醇法大豆濃縮蛋白的溶解度增大[5]；也有研究發現大豆濃縮蛋白經胰蛋白酶修飾至水解度為1%，可以顯著提高修飾產品的溶解性和保水性[6]。將大豆蛋白與多羥基的化合物進行復合，即糖基化反應可以提高大豆蛋白的溶解性，等電點附近也呈現較好的溶解性：陳中等[7]將蛋白質充分糖基化后制備了一種高穩定性的酸性蛋白飲料；將葡聚糖10萬和乳清蛋白進行美拉德反應，發現蛋白在酸性條件下的溶解度提高、熱穩定性增強[8]；而通過干熱接枝反應制備的糖苷化蕓豆蛋白，也能顯著改善蕓豆蛋白的溶解度[9]；酪蛋白-葡聚糖接枝物在酸性范圍內，隨著接枝度的增大，溶解度不斷增大，在等電點附近，濕法和干法接枝物的溶解度分別提高至40%和30%左右[10]。本實驗結合生物學方法(酶水解)和化學方法(糖基化)對大豆濃縮蛋白進行修飾，確定大豆濃縮蛋白酶解及糖基化條件，為提高大豆濃縮蛋白在食品領域的應用，尤其是等電點附近高溶解性產品開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆濃縮蛋白(蛋白質含量為51.41%) 大慶日月星公司；木瓜蛋白酶 北京奧博星生物技術有限責任公司；葡聚糖(分子質量2×104u) 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HYP-1014消化爐 上海纖檢儀器有限公司；LNK-871凱氏定氮儀 江蘇省宜興市科教儀器研究所；FE20 pH計 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；BIO-RAD垂直電泳槽 伯樂生命科學研究發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 氮溶指數測定

稱取大豆濃縮蛋白0.20g，放入消化管中，按照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質的測定》中的微量凱氏定氮法測定其蛋白含量，為總氮含量。稱取大豆濃縮蛋白15.00g，常溫溶解于300mL蒸餾水中，電動攪拌30min，然后轉移至離心管中，3000r/min離心10min，取上清液10mL，放入消化管中，按照GB/T 5009.5—2003中的微量凱氏定氮法測定其蛋白含量，為可溶性氮含量。氮溶指數定義如下：

1.3.2 木瓜蛋白酶比活力的測定

目前國內通用的蛋白酶的活力單位定義為1min水解出1μg酪氨酸的酶量稱為1U。參照參考文獻[11]，測得木瓜蛋白酶的比活力為320U/mg。

1.3.3 木瓜蛋白酶水解最佳條件的優化

配制一定大豆蛋白與水質量配比的大豆濃縮蛋白溶液，用1mol/L NaOH溶液將蛋白溶液pH值調至7.0，于不同溫度下加入木瓜蛋白酶水解30min。反應過程中使用pH計，通過滴加NaOH溶液，保持酶解反應體系的pH值穩定在7.0。水解完成后，將水解液煮沸10min使酶失活。

通過單因素試驗，確定大豆蛋白與水質量配比、酶添加量、溫度等因素對氮溶指數的影響，確定最佳酶解反應條件。

1.3.4 大豆蛋白糖基化條件的優化

在確定的最佳條件下進行水解，然后向酶解后的大豆濃縮蛋白體系中添加合適比例的葡聚糖，置于95℃水浴中攪拌反應，一定時間后置于涼水浴冷卻，停止反應。將溶液pH值調至4，離心取上清液。以氮溶指數為指標，確定最佳糖基化條件。

1.3.5 十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE)

選擇5%的濃縮膠和15%的分離膠，蛋白進樣量為4μL。電泳開始時電壓為80mV左右，蛋白進入分離膠后，改為120mV。觀察酶解及糖基化修飾前后大豆濃縮蛋白分子質量分布情況及結構變化。

2 結果與分析

2.1 酶水解條件的優化

2.1.1 大豆蛋白與水質量配比對SPC氮溶指數的影響

圖1 大豆蛋白與水質量配比對SPC氮溶指數的影響Fig.1 Effect of SPC concentration on NSI

如圖1所示，未處理的SPC在低大豆蛋白與水質量配比(1∶100、2∶100)時氮溶指數較低，但變化不顯著(P＜0.05)；隨著大豆蛋白與水質量配比升高，氮溶指數升高；當大豆蛋白與水質量配比過高(5∶100、6∶100)時，過量的蛋白發生聚沉，氮溶指數下降。酶水解后的SPC氮溶指數有大幅提高，大豆蛋白與水質量配比較低(1∶100、2∶100)時，大豆蛋白分散體系較開闊，有利于酶充分作用于底物，因此氮溶指數提高較大，但是水解過程中底物濃度太低，不利于進一步利用，因此大豆蛋白與水質量配比確定為5∶100比較適宜。

2.1.2 酶添加量對SPC氮溶指數的影響

如圖2所示，隨著酶添加量逐漸增大，SPC氮溶指數逐漸提高，這是由于酶將大分子的不溶性蛋白水解成了小分子的可溶性肽段和氨基酸，底物充足時，酶添加量越大，水解后生成的可溶性肽比例越高，氮溶指數就越高。當酶添加量為10000U/g時，氮溶指數由水解前的76.56%提高到96.66%，當酶添加量為12000U/g時，氮溶指數提高到96.69%，二者差異并不顯著(P＜0.05)。說明當酶添加量達到一定水平后，底物已被酶所飽和，反應速度達到最大，再增大酶添加量，水解度增加將不明顯[12]。因此選擇酶添加量為10000U/g。

圖2 酶添加量對SPC氮溶指數的影響Fig.2 Effect of papain amount on NSI of SPC

2.1.3 酶解反應溫度對SPC氮溶指數的影響

圖3 反應溫度對SPC氮溶指數的影響Fig.3 Effect of temperature on NSI of SPC

隨著反應溫度升高，氮溶指數逐漸提高。當酶水解溫度保持在55～60℃時，SPC氮溶指數最高。溫度繼續上升，氮溶指數緩慢下降。溫度偏低或偏高都不利于酶發揮最高活力[11]，因此反應溫度選擇在55～60℃。

選擇大豆蛋白與水質量配比5∶1 0 0、酶添加量10000U/g、反應溫度55～60℃進行酶水解反應，產物用于進一步糖基化反應。

2.2 優化酶解條件下SPC的氮溶指數

在優化條件下對SPC進行處理，檢測酶解前后SPC氮溶指數隨pH值的變化情況。如圖4所示，酶解后SPC氮溶指數普遍提高，一些pH值條件下氮溶指數接近100%。但是在pH4～6附近氮溶指數仍舊較低，與其他pH值條件下相差較大，這影響了其在中等酸度食品中的應用。為提高大豆濃縮蛋白等電點附近的溶解性，試驗對酶解大豆蛋白繼續進行改性，即糖基化修飾。

圖4 pH值對SPC氮溶指數的影響Fig.4 Effect of pH value on NSI of SPC

2.3 大豆蛋白糖基化條件的優化

2.3.1 葡聚糖與蛋白配比對糖基化大豆蛋白氮溶指數的影響

圖5 葡聚糖與蛋白配比對糖基化大豆蛋白氮溶指數的影響Fig.5 Effect of dextran amount on NSI of SPC

如圖5所示，隨著葡聚糖與蛋白配比的提高，它與肽分子之間碰撞的幾率大大增加，有利于反應的進行。葡聚糖與蛋白配比0.5∶1～1∶1時，氮溶指數較高。但是，葡聚糖與蛋白配比增加到一定程度，由于肽分子和多糖分子的空間位阻，分子之間的碰撞幾率會減少，不利于反應的進行[9]。由于多糖鏈的引入，多羥基的親水性使蛋白質在pH4(等電點附近)溶解性得到提高，由25.90%提高到39.12%。葡聚糖量少時，形成的蛋白質-多糖復合物親水基不足以保證蛋白質在其等電點的穩定性；葡聚糖量大時，由于大分子多糖形成的空間位阻也降低了蛋白質的穩定性。

2.3.2 糖基化時間對糖基化大豆蛋白氮溶指數的影響

圖6 糖基化時間對糖基化大豆蛋白氮溶指數的影響Fig.6 Effect of glycosylation time on NSI of SPC

隨著反應時間的延長，蛋白質分子的側鏈氨基與多糖分子的末端不飽和羰基反應逐漸形成穩定的共價鍵，形成以多羥基多糖部分為親水基，蛋白質部分為疏水基的大分子，多糖與蛋白質受熱逐步結合，反應程度逐漸提高。但是反應時間過長會導致蛋白質結構過度伸展，增加蛋白質間的相互作用增加，以及多糖的空間阻礙，導致凝聚和沉淀，蛋白質氮溶指數下降。

2.4 SDS-PAGE

圖7 大豆濃縮蛋白酶解及糖基化修飾產物電泳圖Fig.7 SDS-PAGE of SPC, SPC hydrolysate and glycosylated SPC hydrolysate

由圖7可以看出，酶解后蛋白質分子質量下降，形成了可溶性低分子質量多肽；糖基化后，上部較大分子質量條帶減少，而分離膠頂端出現一條明顯的大分子條帶，說明多肽與葡聚糖產生了聚合，可溶部分蛋白分子質量增大。

3 結 論

木瓜蛋白酶水解大豆濃縮蛋白的最佳條件是大豆蛋白與水質量配比5∶100、酶添加量10000U/g、反應溫度55～60℃。經此處理在各pH值條件下，酶解后SPC氮溶指數普遍提高。大豆蛋白糖基化的最佳條件是葡聚糖與蛋白配比1∶1、反應時間3.5h。經木瓜蛋白酶水解及糖基化修飾后大豆濃縮蛋白在pH4的氮溶指數由9.53%提高至39.12%。

本實驗對大豆濃縮蛋白溶解性的提高進行了嘗試，尤其是其在pH4時的溶解度得到了顯著改善。但是對大豆濃縮蛋白增溶的分子機理研究還不透徹，需要在今后的研究中進一步探討。

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Effect of Papain Hydrolysis and Glycosylation on Solubility of Soybean Protein Concentrate

ZHANG Lin-jing，YU Guo-ping*
(School of Food, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

In order to increase the solubility of soybean protein concentrate (SPC) at the isoelectric point, SPC was hydrolyzed by papain to form soluble protein and then glycosylated with dextran to form a hydrophilic protein-polysaccharide complex. The best hydrolysis conditions of SPC were determined as follows∶ SPC concentration 5%, papain concentration 10000 U/g, and temperature 55-60 ℃. The best glycosylation was achieved after 3.5 h of reaction at a dextran/SPC ratio 1∶1. As a result, the nitrogen solubility index of SPC near the isoelectric point increased from 9.53% to 39.12%. The obtained soybean protein soluble at the isoelectric point can have more applications in moderately acidic foods.

soy protein concentrate；papain；glycosylation；solubility

TS201.2

A

1002-6630(2011)16-0001-04

2010-09-28

國家“863”計劃項目(2006AA10Z322)；哈爾濱科技創新人才研究專項(2006RFQXN014)

張琳靜(1986—)，女，碩士，研究方向為食品化學。E-mail：zlj1986112@126.com

*通信作者：于國萍(1963—)，女，教授，博士，研究方向為食品化學。E-mail：yuguopingneau@hotmail.com