大豆抗癌肽的初步提取及抗癌活性

葛錫娟，許 巖，楊麗麗，吳 非*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

大豆抗癌肽的初步提取及抗癌活性

葛錫娟，許 巖，楊麗麗，吳 非*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

確定大豆抗癌肽最佳提取條件，并對其抗癌活性進(jìn)行檢測。大豆經(jīng)乙醚、石油醚或正己烷脫脂預(yù)處理后，分別對大豆粉過篩目數(shù)、脫脂粉添加量和超聲波處理時間進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計，通過對胃癌細(xì)胞SGC-7901生長抑制率的影響，探討大豆抗癌肽的最佳提取條件；采用四噻唑藍(lán)比色法 (MTT法)對不同處理?xiàng)l件下的大豆提取物進(jìn)行抗癌活性檢測。結(jié)果表明：大豆抗癌肽最佳提取條件為乙醚脫脂、過80目篩、脫脂粉添加量3g/15mL PBS緩沖液(pH7.4)、超聲波處理時間80min，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，此條件下癌細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到39.03%。

大豆；抗癌肽；提取；生物學(xué)活性

近10年來，流行病學(xué)研究顯示，癌癥仍然是導(dǎo)致死亡的主要原因之一。我國每年新增癌癥患者近200萬人，每年因癌癥死亡約150萬人，位居各類死因第一位[1]。體外試驗(yàn)表明，抗癌肽通過抑制癌細(xì)胞的DNA來誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，這對抑制癌細(xì)胞發(fā)展和轉(zhuǎn)移都有重要意義[2-3]。近期研究顯示，大豆中含有一種新型的預(yù)防癌癥的物質(zhì)——Lunasin。它是一種含有43個氨基酸的多肽，主要通過抑制核心組蛋白乙酰化從而引起癌細(xì)胞凋亡[4-6]。De Mejia等[7]、Jeong等[8-9]都對這種肽的提取和抗癌活性進(jìn)行了研究。國內(nèi)對大豆多肽的研究主要集中在抗氧化性、抗高血壓性、降血脂和降膽固醇方面[10-15]，有關(guān)大豆抗癌肽的報道較少。其中，大豆抗癌肽的提取主要經(jīng)過酶解法或微生物分解法[16]，酶解產(chǎn)物不但成分復(fù)雜而且不易控制，大大增加了加工成本。

本實(shí)驗(yàn)采用四噻唑藍(lán)比色法(MTT)對抗癌活性進(jìn)行體外試驗(yàn)研究，探討大豆粉脫脂溶劑、目數(shù)、脫脂粉添加量以及超聲波處理時間對大豆抗癌肽提取的影響，以胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率為檢測指標(biāo)，確定最佳的提取條件，通過對大豆抗癌肽提取條件的研究，以期為大豆抗癌肽在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 市售；人胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞 武漢博士得試劑公司；RPMI1640 上海索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清(FBS) 杭州四季青生物工程材料有限公司；磷酸緩沖液(PBS，pH7.4) 哈爾濱鑫豐生物材料有限公司；胰酶(Typein，1∶250) 美國Amresco公司；噻唑藍(lán)[3(4,5-dimethylthiazo2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide，MTT] 美國Amresco公司；二甲基亞颯(dimethyl sulfoxide，DMSO，分析純) 中國醫(yī)藥集團(tuán)(上海)試劑公司；乙醚、石油醚、正己烷(均為分析純) 天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；青霉素-鏈霉素溶液等。

1.2 儀器與設(shè)備

酶聯(lián)免疫檢測儀 美國BIO-RAD公司；超聲波振蕩儀、電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；IMT-413倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所；CO2培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；pHS-3C型pH計 上海偉業(yè)儀器廠；手提式粉碎機(jī) 上海晴友實(shí)業(yè)有限公司；電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；0.22 μm細(xì)菌過濾器等。

1.3 方法

1.3.1 大豆抗癌肽提取

干燥的大豆1kg粉碎后進(jìn)行脫脂，脫脂粉烘干后過篩，備用。取一定量的脫脂大豆粉，加入pH7.4PBS緩沖溶液15mL)，40℃超聲波處理一定時間，每隔10min攪拌一次，取出，4℃、20000×g離心30min，轉(zhuǎn)移上清液，備用。采用MTT法研究不同提取條件對癌細(xì)胞增殖的影響，確定最佳提取條件。

1.3.2 大豆抗癌肽提取條件的優(yōu)化

將粉碎后的大豆粉，分別用乙醚、石油醚、正己烷進(jìn)行脫脂。根據(jù)脫脂溶劑的不同，將試驗(yàn)分成3組并編號，分別為乙醚脫脂處理組、石油醚脫脂處理組、正己烷脫脂處理組。研究在同一脫脂劑處理?xiàng)l件下，改變提取條件時，癌細(xì)胞的增殖情況。以目數(shù)、脫脂粉添加量和超聲波處理時間作為正交因素，經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)(單因素)考慮確定其試驗(yàn)因素的范圍；設(shè)計一個三因素三水平的正交試驗(yàn)，以癌細(xì)胞增殖抑制率為考察指標(biāo)，確定大豆抗癌肽提取的最佳條件。各組的試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 大豆抗癌肽提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in orthogonal array design for optimizing extraction of anticancer peptides from defatted soybean powder

1.3.3 MTT法[17]檢測大豆抗癌肽對人胃癌細(xì)胞SGC-7901生長的影響

1.3.3.1 培養(yǎng)細(xì)胞

將復(fù)蘇后的SGC-7901細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 164 0培養(yǎng)液(pH7.4)中，于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37℃飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿瓶底80%左右時用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化傳代。2～3d換液并傳代，取處于對數(shù)生長期的同一代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3.2 接種細(xì)胞

質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶消化貼壁生長的細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)10% FB S(胎牛血清)、100mg/L青霉素和100mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，以每孔200μL(共4000～5000個細(xì)胞)接種于96孔培養(yǎng)板中。

1.3.3.3 培養(yǎng)細(xì)胞

將培養(yǎng)板移入CO2培養(yǎng)箱，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2及飽和濕度條件下，培養(yǎng)24h。

1.3.3.4 加入提取物

將不同處理的大豆提取液過0.22μm濾膜除菌，每孔分別加入濾液100μL，同時設(shè)置5個平行孔，空白對照為RPMI 1640培養(yǎng)液。

1.3.3.5 呈色

加藥完畢繼續(xù)孵育48h后，每孔加入5mg/mL MTT溶液20μL，37℃繼續(xù)孵育4h，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，控干后每孔加入150μL DMSO，輕輕振蕩15min，使藍(lán)紫色甲瓉結(jié)晶物充分溶解。

1.3.3.6 比色

選擇波長490nm，在酶標(biāo)儀上測定各孔光密度值(OD490)，記錄結(jié)果。

1.3.3.7 抑制率計算公式

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間檢驗(yàn)用ANOVA方差分析，數(shù)據(jù)以χ±s表示；方差齊性時用最小顯著差法(least significant difference，LSD)檢驗(yàn)，方差不齊時用Tamhane,s檢驗(yàn)；檢驗(yàn)的顯著性水平為α=0.05(顯著水平)和α=0.01(極顯著水平)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醚脫脂處理大豆抗癌肽提取正交試驗(yàn)

MTT法檢測結(jié)果表明，目數(shù)、脫脂粉添加量、超聲波處理時間正交試驗(yàn)的9組大豆提取物對胃癌細(xì)胞抑制作用表現(xiàn)為：細(xì)胞折光性增加，壁厚、變圓、黏連、破碎、脫落，OD值明顯下降。從表2中R值可以看出因素主次順序?yàn)椋篊＞B＞A從K值可知，最佳組合為C3B3A2，即在乙醚作為脫脂劑的條件下，大豆抗癌肽的最佳提取條件為超聲波處理時間80min、脫脂粉添加量3g、過篩目數(shù)80目。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)此時癌細(xì)胞生長抑制率達(dá)到39.03%。

表2 乙醚脫脂條件大豆抗癌肽提取正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design for optimizing extraction of anticancer peptides from ether-defatted soybean powder and corresponding experimental results

2.2 石油醚脫脂處理大豆抗癌肽提取正交試驗(yàn)

表3 石油醚脫脂條件大豆抗癌肽提取正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 3 Orthogonal array design for optimizing extraction of anticancer peptides from petroleum ether-defatted soybean powder and corresponding experimental results

經(jīng)過石油醚脫脂，超聲波處理的大豆提取物對體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞有抑制作用。加入不同處理樣，其胃癌細(xì)胞的抑制作用明顯不同。由表3中R值可知因素主次順序?yàn)椋篈＞C＞B。從K值可知，最佳組合為C2A2B2，即在石油醚作為脫脂劑的條件下，大豆抗癌肽的最佳提取條件為超聲波處理時間60min、過篩目數(shù)80目、脫脂粉添加量2g。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)此時癌細(xì)胞生長抑制率達(dá)到25.59%。

2.3 正己烷脫脂處理大豆抗癌肽提取正交試驗(yàn)

試驗(yàn)以對胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長抑制作用作為反映抗癌活性的指標(biāo)。由表4中R值可知因素主次順序?yàn)椋篊＞B＞A，從K值可知，最佳組合為C1B1A1，即在正己烷作為脫脂劑的條件下，大豆抗癌肽的最佳提取條件為超聲波處理時間40min、脫脂粉添加量1g、過篩目數(shù)40目。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，此時癌細(xì)胞生長抑制率達(dá)到19.21%。

表4 正己烷脫脂條件大豆抗癌肽提取L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 4 Orthogonal array design for optimizing extraction of anticancer peptides from n-hexane-defatted soybean powder and corresponding experimental results

大豆提取液作用48h后，乙醚、石油醚、正己烷3組試驗(yàn)在最佳提取條件下癌細(xì)胞的抑制率依次是(39.03± 3.86)%、(25.59±2.64)%、(19.21±3.19)%。通過方差分析，正交試驗(yàn)的各試驗(yàn)組別之間差異不顯著(P＞0.05)；大豆脫脂預(yù)處理脫脂劑各組間兩兩比較表明，細(xì)胞抑制率均不同，差異顯著(P＜0.05)，進(jìn)一步作兩兩比較，LSD及SNK(student-newman-keuls)檢驗(yàn)表明：乙醚脫脂與石油醚脫脂處理之間差異顯著，P=0.013＜0.05；乙醚脫脂處理與正己烷脫脂之間差異極顯著，P＝0.004＜0.01；石油醚脫脂與正己烷脫脂處理之間P＝0.629＞0.05，差異不顯著。表明不同脫脂預(yù)處理對癌細(xì)胞生長的影響大于試驗(yàn)組別，3種脫脂劑預(yù)處理中，乙醚脫脂處理對癌細(xì)胞生長抑制率最高。

通過大豆抗癌提取物雙縮脲反應(yīng)和茚三酮反應(yīng)均呈陽性，說明該抗癌物為肽類物質(zhì)。國內(nèi)外學(xué)者研究表明大豆中一些具有抗癌活性的物質(zhì)如大豆異黃酮、大豆皂甙、凝集素、蛋白酶抑制劑等，其抗癌作用主要集中在抗乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌這一部分[18-20]。其中，大豆異黃酮在體外主要是抑制前列腺癌細(xì)胞系的生長。而且只有其在超生理水平的條件下(IC50＞50μmol/L)，即濃度達(dá)到能引起生長抑制時，才能觀察到前列腺癌細(xì)胞凋亡時出現(xiàn)的DNA片段[21]。相反，在低濃度條件下，大豆肽能抑制體外胃癌細(xì)胞的生長。Park等[22]研究表明大豆中存在一種名為Lunasin的抗癌肽，這種肽具有強(qiáng)烈的抑癌作用。這對今后大豆抗癌肽的分離精制，提取其高附加值部分有指導(dǎo)意義。

3 結(jié) 論

通過體外細(xì)胞試驗(yàn)可以看出，大豆抗癌肽的初步提取物有明顯抑制癌細(xì)胞增殖的作用。 在最優(yōu)條件下3種脫脂劑預(yù)處理對癌細(xì)胞生長抑制率分別為39.03%、25.59%、19.21%。因此，大豆抗癌肽的最佳提取條件為選用乙醚脫脂、過篩目數(shù)80目、脫脂粉添加量3g、超聲波處理時間80min，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，此條件下，癌細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到39.03%。

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Extraction and Activity Evaluation of Anticancer Peptides from Soybean

GE Xi-juan，XU Yan，YANG Li-li，WU Fei*
(School of Food, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Dried soybean powder was defatted with either petroleum ether, n-hexane or ethyl ether before the extraction of anticancer peptides with PBS buffer (pH 7.4) under ultrasonic assistance. In order to maximize the inhibitory rate of anticancer peptides against human gastric cancer cell line SGC-7901, a three-factor, three-level orthogonal array design was used to optimize three operating conditions including material particle size, solid-to-liquid ratio and ultrasonic treatment time. Anticancer activity evaluation of anticancer peptides extracted from defatted soybean was carried out using MTT assay. The optimal extraction conditions were determined as follows∶ material particle size 80 mesh, solid-to-liquid ratio 1∶5 (g/mL) and ultrasonic treatment time 80 min. The inhibitory rate of the extract under these conditions against the proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901 was 39.03%.

soybean；anticancer peptide；extraction；biological activity

TS214.6

A

1002-6630(2011)16-0027-04

2010-10-20

哈爾濱市科技創(chuàng)新人才基金項(xiàng)目(2008RFQXN016)；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究面上項(xiàng)目(11531016)

葛錫娟(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：xijuange@163.com

*通信作者：吳非(1968—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)榇蠖巩a(chǎn)品精深加工。E-mail：wfneau@163.com