親和層析法分離純化納豆激酶

劉 柳，李南薇，郭 勇

(1.暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632；2.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225；3.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510641)

親和層析法分離純化納豆激酶

劉 柳1，李南薇2，郭 勇3

(1.暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632；2.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225；3.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510641)

目的：以納豆激酶的作用底物纖維蛋白為配基制備親和層析膠，分離純化納豆激酶。方法：納豆桿菌發酵液經硫酸銨分段鹽析、透析得粗酶，在4℃條件親和層析法分離純化，利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)對酶純度進行檢驗。結果：經親和層析得納豆激酶為電泳純，純化倍數為8.3，回收率43.9%。純酶的最適pH值和溫度分別為pH7.0～9.0、50℃；溫度高于60℃纖溶酶活性迅速下降；在pH6.0～10.0范圍內穩定性好；Mg2＋對其有微弱激活作用，Cu2+有顯著抑制作用。結論：以瓊脂糖包埋纖維蛋白制備的層析膠可用于納豆激酶的快速分離純化。

納豆激酶；分離純化；親和層析；纖維蛋白；酶學性質

1987年，日本學者須建洋行首次發現日本傳統的大豆發酵食品納豆中含有溶解血纖維蛋白的成分，并將其命名為納豆激酶(nattokinase，NK)[1]。與傳統的溶栓劑相比，NK具有不易引起出血、無抗原性、半衰期長、安全無毒且成本低廉和能口服吸收溶栓等優點，因而具有廣闊的開發前景，可能成為新一代的溶栓藥物[2]。目前，國內對該酶的提取途徑主要是選高產酶的納豆菌株發酵，再通過等電點法、鹽析法、層析法等方法提取發酵液中的納豆激酶[3]。本實驗擬利用高產酶的納豆桿菌發酵，發酵液經硫酸銨分段鹽析、透析得納豆激酶粗酶液，粗酶液過親和層析柱分離出納豆激酶純酶；對純酶最適溫度與pH值、穩定性等酶學性質進行研究，為進一步開發和利用該酶提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis subsp natto)由實驗室保存；纖維蛋白原、人凝血酶、尿激酶(純度＞99%)中國藥品生物制品檢定所；瓊脂糖 北京鼎國生物技術有限公司；苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF) 南京賽吉科技有限公司；胃酶抑素A(Pepstain A)、亮抑酶肽(Leupeptin) 美國Amresco公司；抑肽酶(Aprotinin) 美國Sigma-Aldrich公司；其他生化試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

蛋白電泳分析儀 美國Bio-Rad 公司；UV-1800紫外可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；FD-1冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器公司；DUPONT-RC5C低溫高速離心機 美國GT Soral公司。

1.3 親和層析介質的制備

將一定量人血纖維蛋白原以50mg/mL溶于無菌水中，37℃恒溫直至完全溶解；將瓊脂糖溶于40mmol/L pH7.8巴比妥鈉-HCl緩沖液中配制成15mg/mL的溶液，滅菌后冷卻至50℃；加入已經溶解的纖維蛋白原和適量的人凝血酶，恒溫30min；用注射器滴入預冷至4℃的四氯乙烯中，制成球形顆粒。去離子水清洗包埋顆粒后于37℃恒溫2h后再做交聯，交聯劑為40mg/mL的戊二醛水溶液。去離子水清洗后于4℃保存備用。

1.4 納豆激酶的分離純化

1.4.1 納豆激酶的粗提取

在100mL三角燒瓶中分裝20mL LB培養基，接種一環斜面保藏的納豆枯草芽孢桿菌，150r/min、35℃，搖床振蕩培養20h。6mL培養液加至裝有200mL發酵培養基(含可溶性淀粉10mg/mL、大豆蛋白胨10mg/mL、磷酸氫二鉀4mg/mL、磷酸二氫鈉4mg/mL、硫酸鎂0.75mg/mL、氯化鈣0.2mg/mL；pH7.0～7.2)的500mL三角燒瓶中，150r/min，35℃搖床振蕩培養72h。發酵結束后，8000r/min離心20min，收集上清液。

上清液加硫酸銨至飽和度30%，4℃靜置5h，12000r/min離心20min取上清；繼續加硫酸銨至飽和度為65%，4℃靜置過夜，12000r/min離心20min取沉淀用10mL 0.04mol/L pH8.0巴比妥鈉-HCl緩沖液溶解、透析后得粗酶液備用。

1.4.2 親和層析

將制備好的層析膠裝于層析玻璃柱(φ1 0 m m× 200mm)中；先用10mL上樣緩沖液(0.04mol/L pH7.8巴比妥納-HCl)平衡柱，手動上樣一定體積V0粗酶液，測其酶活為E0；再用一定量上樣緩沖液平衡柱，直至洗出液中檢測不出酶活為止，收集洗出液，測量體積V1、酶活E1；最后洗脫緩沖液(0.04mol/L pH5.6巴比妥納-HCl)洗脫，直至洗出液中檢測不出酶活為止，收集洗脫液，測量體積V2、酶活E2。

1.5 溶栓酶活力的測定

采用纖維蛋白平板法。參照并改良Astrup法[4]制備雙層纖維蛋白平板，依照楊明俊[5]、Painter[6]、韓秋霞[7]等報道的纖維蛋白平板法稍加改良，制作瓊脂-瓊脂糖雙層平板。標準曲線方程為：y=0.9335χ-9.3208 (y為納豆激酶活力/U，χ為溶圈垂直直徑乘積/(mm2)，R2=0.9934。

1.6 蛋白質含量的測定

參照Bradfor法[8]。以牛血清白蛋白為對照標準，標準曲線方程：y＝117.03χ(R2=0.9959)，式中，y為蛋白質濃度/(mol/mL)，χ為吸光度。

1.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE)凝膠電泳

采用不連續的凝膠系統，聚丙烯酰胺質量分數分離膠12%、濃縮膠5%，恒定電流于每塊電泳板8mA，考馬斯亮藍染色。

1.8 納豆激酶的酶學性質

1.8.1 最適溫度、pH值

在不同溫度檢測纖溶酶活力；選擇不同pH值的緩沖液溶解酶粉，用相應pH值的緩沖液配制纖維蛋白平板，以最高酶活為100%，計算相對酶活。

1.8.2 抑制劑、金屬離子對酶活的影響

1.0 mmol/L PMSF(溶劑為異丙醇)，0.25mmol/L PepstainA(溶劑為甲醇)，0.25mmol/L Leupep tin，10mmol/L EDTA。各抑制劑與酶液以體積比1∶1混合，振勻，測定酶活。配制CaCl2、CoCl2、CuSO4、MgCl2、MnSO4、FeCl2和ZnCl2溶液，與酶液適當比例混合，使各金屬離子終濃度分別為5.0mmol/L，測定酶活，以稀釋相應倍數酶為對照，計算相對酶活。

1.8.3 纖溶酶的穩定性

溫度穩定性：酶液置于不同溫度(4、25、37、45、50、60、65、70℃)恒溫1h，緩慢降溫至37℃測定活力，記錄37℃條件4h內酶活變化情況。pH值穩定性：配制不同pH值(pH3.5～13)的緩沖液與酶液1∶1混合， 37℃恒溫40min，以稀釋兩倍的酶液作為對照，記錄相對酶活。

2 結果與分析

2.1 納豆激酶的分離純化

親和層析柱上樣0.6mL粗酶液，平衡后用pH5.6的洗脫液洗脫，過柱時間為4h，得分離純化的結果如表1所示，吸附率52.9%，洗脫率96.7%，本步驟回收率51.2%。

與發酵上清液相比較，納豆激酶純化倍數達到8.3，總回收率為43.9%(表2)。親和層析后酶液經SDS-PAGE電泳檢測為一條帶(圖1)，經計算納豆激酶亞基的分子質量約為27.2kD。這與筆者用陰陽離子交換和疏水柱層析法得到的結果一致[9]，但是純化步驟減少了兩步，比王萍等[10]的研究總回收率提高了30%。但是本方法分離納豆激酶每次處理的樣品量很少，僅為500U左右，馬躍華等[11]研究證明大豆顆粒對納豆激酶的親和吸附特性，未來將嘗試將大豆顆粒與纖維蛋白聯合制作親和膠以提高分離純化能力。

表1 納豆激酶親和層析結果Table 1 Purification of nattokinase by affinity chromatography

表2 納豆激酶分離純化結果Table 2 Separation and purification results of nattokinase

圖1 納豆激酶SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1 SDS-PAGE of nattokinase

2.2 納豆激酶的酶學性質

2.2.1 最適溫度

圖2 溫度對納豆激酶相對酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on nattokinase activity

納豆激酶在50℃時的相對酶活力最高；45～55℃，相對酶活均在95%以上，為最適反應溫度范圍；隨溫度升高相對酶活力下降，溫度60℃以上時相對酶活在20%以下。

2.2.2 最適pH值

圖3 pH值對納豆激酶相對酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on nattokinase activity

納豆激酶最適pH值范圍為pH7.0～9.0， pH值的降低對酶活的影響明顯，pH值為11.0時，納豆激酶相對酶活仍有80%。

2.2.3 抑制劑對酶活的影響

圖4 抑制劑對納豆激酶相對酶活力的影響Fig.4 Effect of inhibitors on nattokinase activity

亮抑酶肽(Leupeptin)與胃酶抑素(Pepstain)只能部分抑制纖溶酶活性。苯甲基磺酰氟(PMSF在濃度為0.5mmol/L時即可完全抑制纖溶酶活性，EDTA對酶活性基本沒有影響。PMSF為絲氨酸蛋白酶抑制劑，可推斷納豆激酶屬于絲氨酸蛋白酶，屬于金屬蛋白酶的可能性非常小。

2.2.4 金屬離子對酶活的影響

圖5 金屬離子對納豆激酶相對酶活力的影響Fig.5 Effect of metal ions on nattokinase activity

Mg2+有微弱的激活作用，Cu2+對納豆激酶的抑制作用最明顯，Ca2+無明顯作用；其他金屬離子對酶活有不同程度的抑制作用。這與前人的研究結果不盡相同[12-16]。

2.2.5 纖溶酶的穩定性

2.2.5.1 熱穩定性

圖6 溫度對納豆激酶穩定性的影響Fig.6 Effect of temperature on stability of nattokinase

納豆激酶在溫度低于60℃恒溫1h后，相對酶活仍有80%以上，溫度高于60℃，酶活力迅速喪失(圖6)。而圖2顯示溫度高于55℃時，酶活急劇下降，可見60℃恒溫1h變性后的納豆激酶，在緩慢降溫至37℃后蛋白酶部分復性。

圖7 37℃納豆激酶酶活變化情況Fig.7 Effect of temperature on nattokinase stability

由圖7可知，37℃納豆激酶在4h內相對酶活力都保持在75%以上，作為食源性藥品可以在人體內存在較長時間，更好地發揮藥效。

2.2.5.2 pH值穩定性

圖8 pH值對納豆激酶穩定性的影響Fig.8 Effect of pH on nattokinase stability

由圖8可知，納豆激酶在pH6～11范圍內穩定性好，相對酶活在80%以上。pH5.6、37℃保溫40min，相對酶活為65.3%。

3 結 論

納豆激酶在4℃、pH7.8條件下與纖維蛋白結合但是不發生反應，在pH5.6時與纖維蛋白分離。故以瓊脂糖為載體、纖維蛋白為配基制成層析膠，分離出納豆激酶經SDS-PAGE電泳檢測為一條帶。與發酵上清液進行比較，納豆激酶純化倍數達到8.3，總回收率為43.9%。親和層析介質可以反復使用，從而降低了分離成本、節約了時間和人力。對納豆激酶酶學性質研究發現，最適pH值和溫度分別為pH7.0～9.0、50℃；37℃恒溫4h酶活力仍在80%以上，pH6～11范圍內穩定性好。Mg2+對納豆激酶有微弱激活作用，Cu2+有顯著抑制作用。

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Affinity Chromatographic Purification of Nattokinase

LIU Liu1，LI Nan-wei2，GUO Yong3
(1. Department of Food Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China；2. College of Light Industry and Food Technology, Zhongkai University of Agricultural and Engineering, Guangzhou 510225, China；3. School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China)

Objective∶ To separate and purify nattokinase by fibrin affinity chromatography. Methods∶ The fermentation supernatant of Bacillus subtilis subsp. natto was fractionally salted out with ammonium sulfate and dialyzed, and the crude nattokinase obtained was purified by affinity chromatographic column chromatography at 4 ℃. The purity of purified nattokinase was analyzed by SDS-PAGE. Results∶ Nattokinase of electrophoretical purity was obtained, with a purify fold of 8.3 and a recovery of 43.9%. The optimum reaction pH and temperature pf purified nattokinase were 7.0-9.0 and 50 ℃, respectively. The enzyme activity exhibited a sharp drop at temperatures above 60 ℃ and good stability in the pH range of 6.0-10.0. The enzyme was slightly activated by Mg2+but dramatically inhibited by Cu2+. Conclusion∶ Affinity chromatography on fibrinagarose is applicable to fast purify nattokinase.

nattokinase；purification；affinity chromatography；fibrin；characterization

TS201.2

A

1002-6630(2011)16-0058-04

2010-11-19

劉柳(1981—)，女，助理實驗師，碩士，研究方向為食品生物技術。E-mail：cdliuliu@126.com