鹽角草總黃酮提取工藝優(yōu)化

趙夢丹，王仁雷，周 峰，周泉澄，周紅霞，華 春,*，李建玲

(1.南京師范大學生命科學學院，江蘇 南京 210046；2.南京曉莊學院生物化工與環(huán)境工程學院，江蘇 南京 211171；3.江蘇教育學院生物系，江蘇 南京 210013)

鹽角草總黃酮提取工藝優(yōu)化

趙夢丹1,2，王仁雷3，周 峰2，周泉澄2，周紅霞2，華 春2,*，李建玲1

(1.南京師范大學生命科學學院，江蘇 南京 210046；2.南京曉莊學院生物化工與環(huán)境工程學院，江蘇 南京 211171；3.江蘇教育學院生物系，江蘇 南京 210013)

采用分光光度法，以蘆丁為標準品測定鹽角草中的總黃酮含量。通過單因素試驗分析乙醇體積分數(shù)、固液比、回流時間及回流溫度4個主要因素對鹽角草中總黃酮提取率的影響。在單因素試驗的基礎上通過正交設計法優(yōu)化鹽角草總黃酮提取工藝條件。結果表明：鹽角草總黃酮的最佳提取工藝條件為乙醇體積分數(shù)80%、固液比1∶50、回流溫度70℃、提取時間4h。此條件下鹽角草的總黃酮得率25.172mg/g。實驗結果可能為今后鹽角草資源的開發(fā)利用提供重要的理論依據(jù)。

鹽角草；總黃酮；熱回流提取；正交試驗

鹽角草(Salicornia europae a L.)，隸屬藜科(Chenopodiaceae)鹽角草屬(Salicornia L.)。鹽角草可在含鹽分3%以上的鹽堿灘涂生長，是地球上最耐鹽的陸生高等植物種之一，在江蘇省灘涂及鹽堿地廣泛分布[1]。鹽角草的嫩枝和嫩莖鮮美多汁，是歐洲居民傳統(tǒng)的時蔬之一。種子含油量達到30%，其中不飽和脂肪酸含量十分豐富，亞油酸含量占70%左右，是一種優(yōu)良的鹽土油料作物。鹽角草具有一定的藥用價值，其嫩尖組織中的微量皂角甙，對于降低血管壁上膽固醇的活性具有明顯作用[2-4]具有降壓、降脂、減肥作用。天然黃酮作為生物活性化合物，具有預防和治療高血壓及動脈硬化、抗肝臟毒、抗炎、抗氧化、抗菌及抗病毒、瀉下作用等[5-8]，已被作為甜味劑、抗氧化劑、天然色素在醫(yī)藥、化妝品及食品工業(yè)中被廣泛應用[9-13]。

目前，國內外對鹽角草的研究多為對其耐鹽機理的研究，對鹽角草中黃酮成分及提取工藝研究未見報道。本實驗通過對江蘇鹽城灘涂鹽角草植株中總黃酮提取研究，探討最佳提取工藝，為開發(fā)利用天然保健海水蔬菜鹽角草提一定參考，為實施江蘇沿海開發(fā)國家戰(zhàn)略中有效開發(fā)利用鹽堿灘涂奠定基礎[14]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鹽角草2010年9月采于江蘇鹽城灘涂，為藜科(Chenopodiaceae)鹽角草屬(Salicornia L.)鹽角草(Salicornia europaea L.)。

蘆丁標準品；石油醚、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純。

T6紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；RE-52A型旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；LAC164型電子分析天平(精確至0.0001g) 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；DHG-9141A型電熱恒溫干燥箱上海精宏試驗設備有限公司；回流提取裝置；索氏提取裝置。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

稱取3 7℃烘箱干燥的鹽角草地上綠色部分粉末50g，過40目篩，置500mL錐形瓶中，加100mL石油醚脫脂、脫色2h，重復幾次，至石油醚層幾乎無色，傾去浸提液，樣品置于通風處干燥備用。

1.2.2 標準曲線制備

1.2.2.1 蘆丁標準溶液

精確稱取蘆丁標準品0.0213g，置100mL容量瓶中，加60%乙醇溶解，稀釋至刻度，精確量取25mL，置50mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得每1mL含蘆丁0.1065mg的標準溶液。

1.2.2.2 標準曲線制作

精確吸取標準溶液0.0、2.5、7.5、10.0、12.5mL，分別置于5個25mL容量瓶中，加30%乙醇補足至12.5mL。再加入5%亞硝酸溶液0.75mL，搖勻，放置5min。精確加入10%硝酸鋁溶液0.75mL，搖勻，放置5min。再精確加入1mol/L的氫氧化鈉溶液10mL，用30%的乙醇溶液定容。放置15min，在波長510nm測定吸光度，得到標準曲線的回歸方程A=13.1574C-0.009，r=0.9998。

1.2.3 樣品總黃酮含量的測定

精密量取樣品黃酮提取液10mL，置25mL容量瓶中，加入30%乙醇溶液2.5mL。再加入5%亞硝酸溶液0.75mL，搖勻，放置5min。精確加入10%硝酸鋁溶液0.75mL，搖勻，放置5min。再精確加入1mol/L氫氧化鈉溶液10mL，用30%的乙醇溶液定容。放置15min，在波長510nm作測定吸光度。根據(jù)標準曲線計算提取液中的黃酮含量。總黃酮得率為1g原料中總黃酮的質量(mg)。

式中：Y為總黃酮得率；C為由標準曲線計算得出的待測試液的總黃酮質量濃度/(mg/mL)；V為待測試液的體積/mL；D為待測試液的稀釋倍數(shù)；m為鹽角草粉末質量/g。

1.2.4 精密度實驗

精密吸取蘆丁對照品溶液5mL(0.1065mg/mL)，按1.2.3節(jié)處理，重復測定6次，RSD為0.77%。

1.2.5 穩(wěn)定性實驗

精密吸取蘆丁對照品溶液5mL(0.1065mg/mL)，鹽角草黃酮提取液10mL，按1.2.3節(jié)處理，每5min測定1次吸光度，共測定6次，結果表明顯色后在30min內基本無變化，RSD為0.139%。

1.2.6 回收率測定

精密吸取10mL鹽角草黃酮提取液6份，分別置25mL容量瓶中，加入蘆丁對照品4mL(0.1065mg/mL)，按1.2.3節(jié)處理，平均回收率為99.7%，RSD為0.02%。

2 結果與分析

2.1 不同固液比對提取效果的影響

固液比(g/mL)為變量(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)，精密稱取1.2.1節(jié)處理的鹽角草地上綠色部分粉末2g，然后放入150mL圓底燒瓶中，加入80%乙醇，在80℃水浴回流4h。后用濾紙過濾，濾液待用。按1.2.3節(jié)法測定總黃酮含量。

圖1 固液比對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of solid/liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

由圖1可見，溶劑用量對黃酮得率的影響明顯，隨提取溶劑的增加而先上升后下降。固液比與總黃酮得率的關系顯著(P＜0.05)。其中固液比為1∶40時總黃酮得率最高，為23.68mg/g，與其他因素水平差異顯著，因此，固液比為1∶40時為最佳固液比。

2.2 乙醇體積分數(shù)對提取效果的影響

乙醇體積分數(shù)為變量(60%、70%、80%、95%)，按固液比1∶40加入乙醇，其余操作同2.1節(jié)。

由圖2可見，乙醇體積分數(shù)對黃酮得率的影響明顯，隨乙醇體積分數(shù)的增加而先上升后下降。乙醇體積分數(shù)與總黃酮得率的關系極顯著(P＜0.01)，其中乙醇體積分數(shù)80%時總黃酮得率最高，為21.38mg/g，與其他因素水平差異極顯著(P＜0.01)。當乙醇體積分數(shù)超過80%后，總黃酮得率開始下降，因此，確定乙醇體積分數(shù)在80%較好。

圖2 乙醇體積分數(shù)對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

2.3 不同回流時間對提取效果的影響

回流時間為變量(2、3、4、5、6h)，固液比為1∶40，乙醇體積分數(shù)為80%，其余操作同2.1節(jié)。

圖3 回流時間對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoid

由圖3可見，回流時間對總黃酮得率的影響不是太明顯，但還是可以看出隨著回流時間的增長而呈先增加后下降的變化規(guī)律。回流時間2、3h與總黃酮得率的關系極顯著(P＜0.01)，與4、5、6h水平差異不顯著(P＞0.05)。其中回流時間為3h時總黃酮得率最高，為23.44mg/g。因此，采用的最佳回流時間為3h。

2.4 不同回流溫度對提取效果的影響

回流溫度為變量(60、70、80、90℃)，固液比為1∶40，乙醇體積分數(shù)80%，回流時間為3h，其余操作同2.1節(jié)。

圖4 提取溫度對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield of total flavonoid

由圖4可見，提取溫度對黃酮得率的影響明顯，隨溫度的升高而先上升后下降。提取溫度與總黃酮得率的關系極顯著(P＜0.01)，其中提取溫度為80℃時總黃酮得率最高，為23.82mg/g。當提取溫度超過80℃后，總黃酮得率開始下降，因此，確定提取溫度為80℃。

2.5 正交試驗

選取回流溫度、回流時間、固液比和乙醇體積分數(shù)進行4因素3水平正交試驗。

表1 正交試驗因素及水平Table 1 Factors and their coded levels in orthogonal array design

表2 鹽角草總黃酮提取工藝優(yōu)化L9(34)正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design and corresponding experimental results

從表2極值可知，各因素影響的主次順序為乙醇體積分數(shù)＞固液比＞回流溫度＞回流時間。提取鹽角草總黃酮的最佳工藝為A1B3C2D2，即選用回流溫度70℃、回流時間6h、固液比1∶50、乙醇80%。從節(jié)約能源的角度考慮，回流時間宜采用4h。按A1B2C2D2組合進行3次平行實驗，總黃酮得率為25.172mg/g，說明所選取的工藝確為最佳工藝。

3 討 論

3.1 通過單因素和L9(34)正交試驗確定提取的最佳工藝條件：選用80%乙醇、回流溫度70℃、固液比1∶50、回流時間4h。總黃酮得率為25.172mg/g。驗證實驗結果表明該提取工藝具有穩(wěn)定性好，操作簡便，生產(chǎn)成本較低的優(yōu)點，為進一步開發(fā)鹽角草黃酮資源提供了參考。

3.2 本實驗用石油醚除脂、除色素，以乙醇為提取劑[15]，采用了分光光度法[16]，用蘆丁作標準品，用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH系統(tǒng)作顯色劑[17]，在波長510nm處測定吸光度，所得標準曲線線性良好，回歸方程為A＝13.1574C-0.009，r＝0.9998；顯色穩(wěn)定性在0.5h內良好，RSD為0.139%；精密度實驗RSD為0.77%；加樣回收率99.7%，RSD為0.02%。

3.3 隨著提取分離技術的發(fā)展，目前總黃酮的提取方法主要為回流提取法、超聲法、微波輔助提取法、酶解輔助提取法和超臨界CO2萃取法。從安全性和實用性考慮，回流提取法仍然非常有優(yōu)勢。它方法簡便、設備要求低、成本低廉，最重要的是更易于實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)應用。

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Process Optimization for Extraction of Total Flavonoids from Salicornia europaea L.

ZHAO Meng-dan1,2，WANG Ren-lei3，ZHOU Feng2，ZHOU Quan-cheng2，ZHOU Hong-xia2，HUA Chun2,*，LI Jian-ling1
(1. College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, China；2. School of Biochemical and Environmental Engineering, Nanjing Xiaozhuang College, Nanjing 211171, China；3. Biology Department, Jiangsu Institute of Education, Nanjing 210013, China)

In this study, one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods were used to optimize the conditions for hot reflux extraction of total flavonoids from the shoot of Salicornia europaea L. The determination of total flavonoids was spectrometrically carried out using rutin as the reference standard. The optimal conditions for extracting total flavonoids from the shoot of Salicornia europaea L. were 80% ethanol as the extraction solvent, solid/liquid ratio 1∶50, extraction temperature 70℃, and extraction time 4 h, resulting in a total flavonoid yield of 25.172 mg/g.

Salicornia europaea L.；total flavonoids；hot reflux extraction；orthogonal test

O623.54

A

1002-6630(2011)16-0085-04

2011-04-02

江蘇省高校自然科學基礎研究面上項目(KJD180118)；江蘇省植物生理學精品課程建設項目(2010)；江蘇省現(xiàn)代教育技術研究重點課題(2010)

趙夢丹(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為植物資源開發(fā)與利用。E-mail：zhaomengdan915@hotmail.com

*通信作者：華春(1963—)，女，教授，碩士，研究方向為植物生理學。E-mail：hc3501988@163.com