超聲協同雙水相體系提取路邊青總多酚工藝

歐陽玉祝，張辭海，薛 慧，吳道宏

(1.林產化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000；2.吉首大學食品科學研究所，湖南 吉首 416000)

超聲協同雙水相體系提取路邊青總多酚工藝

歐陽玉祝1,2，張辭海2，薛 慧2，吳道宏2

(1.林產化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000；2.吉首大學食品科學研究所，湖南 吉首 416000)

采用超聲協同乙醇-銨鹽雙水相體系提取路邊青總多酚，通過單因素和正交試驗考查料液比、乙醇初始體積與水初始體積比、提取溫度和提取時間對總多酚提取率的影響。結果表明：最佳工藝為料液比1∶20(g/mL)、乙醇初始體積與水初始體積比0.8、硫酸銨質量濃度0.27g/mL、提取溫度60℃、超聲提取時間60min，總多酚提取率為3.04%。本法是一種提取效率高，時間短，能耗低，不影響提取物活性的新工藝。

雙水相體系；超聲波；路邊青；總多酚

路邊青(Herba gei)的葉和莖中含有豐富的植物多酚和黃酮化合物，具有清熱解毒，抗菌消炎，活血解毒等功能[1]，廣泛用于醫藥、日用化工和食品添加劑領域。目前，國內外對路邊青的研究主要是藥物的臨床應用[2-3]，化學成分分析[4]，多酚和黃酮提取及其抗氧化性[5-10]。超聲波輔助提取是一種提取時間短，提取效率高，能耗低的新提取技術，廣泛用于天然產物活性物質的提取[11-12]；雙水相體系是一種新型的分離技術[13-17]，廣泛應用于天然產物中生物活性物質的分離。本實驗將超聲輔助提取法與乙醇-硫酸銨雙水相體系結合提取路邊青總多酚，探討提取工藝條件。研究結果能為路邊青的利用和天然食品添加劑的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

路邊青于7月采自湖南衡山，新鮮路邊青采回后，經洗凈、去根、晾干、切碎后于60℃、0.1MPa真空干燥，用植物粉碎機粉碎至30目左右備用。無水乙醇、硫酸銨、磷酸氫二鈉、沒食子酸、酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀均為國產分析純試劑。

UV-2450型紫外可見分光光度計 日本島津公司；KQ-250E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SHB-III循環水式多用真空泵、DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿有限公司；FZ102型微型植物粉粹機 天津市泰斯特儀器有限公司；JA2003N型電子天平 上海精密儀器廠；中量制備儀 天津玻璃廠。

1.2 方法

1.2.1 雙水相體系的制備

乙醇-硫酸銨雙水相體系按照文獻[16-17]制備。在無水乙醇中加入一定量的硫酸銨水溶液，利用硫酸銨的鹽析作用形成雙水相體系，通過改變乙醇與水的比例和硫酸銨的用量控制雙水相體系的形成。本實驗選擇雙水相體系的乙醇初始體積與水初始體積比為0.67(醇水比)，硫酸銨質量濃度0.27g/mL配制雙水相。

1.2.2 雙水相提取路邊青總多酚

以總多酚提取率為目標，從提取時間、料液比、乙醇初始體積與水初始體積比(醇水比)和提取溫度4個方面進行單因素試驗和正交試驗。稱取1.0g干燥路邊青粉末于100mL圓底燒瓶中，按一定的料液比加雙水相體系溶液，在一定溫度下超聲提取一定時間，抽濾，濾液靜置，分液，取上層用60%乙醇定容至50mL做為待測液。

1.2.3 標準曲線的繪制

用沒食子酸作標樣，按參考文獻[5]配制系列沒食子酸標準溶液，用紫外可見分光光度計測波長543nm處的吸光度，繪制質量濃度-吸光度標準曲線，經線性回歸得回歸方程：

C=1.7386A，R2=0.9998

式中：C為總多酚質量濃度/(mg/mL)；A為溶液的吸光度。

1.2.4 樣品中總多酚的分析

[5]取1mL待測液置于25mL容量瓶中，以酒石酸亞鐵比色法測定總多酚的含量。用紫外可見分光光度計測波長543nm處的吸光度，結合回歸方程計算提取液中總多酚質量，并計算總多酚提取率。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間對總多酚提取率的影響

稱取干燥路邊青粉末1.00g，以乙醇作溶劑，采用1.2節方法按醇水比0.67，分相鹽質量濃度(硫酸銨質量濃度)0.27g/mL配制雙水相溶液，并按料液比1∶25(g/mL)加雙水相溶液，于50℃溫度超聲提取，考查提取時間對總多酚提取率的影響，結果見圖1。

由圖1可知，隨提取時間的增加，總多酚的提取率先增大后減少，45min時達到最大值2.86%。這是因為多酚化合物受熱時間過長被氧化所致。

圖1 提取時間對總多酚提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on total polyphenol yield

2.1.2 料液比對總多酚提取率的影響

料液比是指路邊青質量與雙水相溶液體積之比，提取溶劑包括雙水相中的乙醇和水(下同)，因此，料液比的大小將直接影響提取效果的好壞。為了考查料液比對總多酚提取率的影響，稱取干燥的路邊青粉末1.00g，以乙醇作為溶劑，采用1.2節方法按醇水比0.67，分相鹽質量濃度(硫酸銨質量濃度)0.27g/mL配制雙水相溶液，并按不同料液比添加雙水相溶液，于50℃溫度超聲提取30min，結果見圖2。

圖2 料液比對總多酚提取率的影響Fig.2 Effect of solid-to-liquid ratio on total polyphenol yield

由圖2可知，料液比太小或太大都不利于總多酚的提取。料液比以1∶20最好，總多酚提取率為2.57%。因為植物多酚在細胞內與糖、蛋白質或生物堿通過苷鍵、酯鍵或氫鍵等疏水鍵結合，要將總多酚浸出，必須破壞疏水鍵。料液比小，溶劑滲透并擴散到植物細胞內的速度以及黃酮化合物向溶劑中擴散的速度小，料液比太大，雖然有利于溶劑進入細胞內，也有利于黃酮化合物向溶劑中擴散，但溶劑用量多，會造成分相鹽用量增大，影響雙水相的穩定性，導致黃酮提取率減小。

2.1.3 醇水比對總多酚提取率的影響

醇水比直接影響雙水相的穩定性，對總多酚提取率有較大的影響。為了考察醇水比對總多酚提取率的影響，稱取干燥的路邊青粉末1.00g，以乙醇作為溶劑，采用1.2節方法按分相鹽質量濃度(硫酸銨質量濃度) 0.27g/mL，在不同醇水比時配制雙水相，并按料液比1∶25加雙水相溶液，于50℃超聲提取30min，抽濾，濾液按1.3節方法測定總多酚的含量，計算總多酚提取率，結果見圖3。

圖3 醇水比對總多酚提取率的影響Fig.3 Effect of volume ratio of initial ethanol to initial water on total polyphenol yield

由圖3可知，醇水比為0.7時最好，總多酚提取率為2.86%。因為醇水比太大，水量過多，進入植物細胞內的提取溶劑對總多酚疏水鍵的斷鍵能力弱，提取率低；醇水比太小，乙醇用量過多，溶劑進入植物細胞的能力差，總多酚提取率也低。

2.1.4 提取溫度對總多酚提取率的影響

溫度升高，分子內能增大，有利于溶劑分子滲透到植物細胞內破壞疏水鍵，因此，溫度對總多酚提取率有較大的影響。稱取干燥的路邊青粉末1.00g，以乙醇作為溶劑，采用1.2節方法按醇水比0.67，分相鹽質量濃度(硫酸銨質量濃度)0.27g/mL配制雙水相，并按料液比1∶25添加雙水相溶液，于超聲波清洗器中加熱超聲提取30min，抽濾，濾液測定總多酚含量，計算總多酚提取率，考查提取溫度對總多酚提取率的影響，結果見圖4。

圖4 提取溫度對總多酚提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on total polyphenol yield

由圖4可知，隨著超聲提取溫度的升高，總多酚提取率增大，到60℃時達最大值2.4%，隨后稍有減小。因為溫度升高，分子內能增大，分子運動加快，有利于溶劑分子滲透進入細胞內破壞疏水鍵，同時，也有利于被提取物質向溶液中擴散。但溫度高于60℃，雙水相體系穩定性變差總多酚物質的氧化加快。

2.2 正交試驗

2.2.1 正交試驗因素水平表

根據雙水相提取總多酚的單因素試驗結果，選擇提取溫度、雙水相醇水比、提取時間和料液比4因素為影響因素，進行L9(34)正交試驗，正交試驗因素水平見表1。

表1 路邊青總多酚提取正交試驗因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in orthogonal array design

2.2.2 路邊青總多酚提取正交試驗結果與分析

表2 路邊青總多酚提取L9(34)正交試驗結果與分析Table 2 Orthogonal array design L9(34) and corresponding experimental results

由表2中正交試驗直觀分析表明：各因素影響程度由大到小依次為：A＞D＞B＞C，最優水平為A2B2C3D2，即用乙醇作提取溶劑，在料液比1∶20、醇水比0.8、溫度60℃條件下超聲提取60min。

2.3 驗證實驗

為了考查最佳提取條件下總多酚的提取效果，用乙醇為提取溶劑，在醇水比0.8，硫酸銨質量濃度0.27g/mL時配制雙水相，于料液比1∶20、溫度60℃、提取時間60min條件下做驗證實驗，結果表明，在最佳條件下，采用超聲協同乙醇-銨鹽雙水相體系提取路邊青總多酚，提取率為3.04%，實驗結果的平均標準相對誤差(RSD)為1.039%。

3 結 論

超聲協同雙水相體系提取路邊青中總多酚具有耗時短、操作簡單、提取與分離同時完成，不影響多酚活性的優點。結果表明，用乙醇為提取劑，在乙醇初始體積與水初始體積比0.8、硫酸銨質量濃度0.27g/mL配制雙水相，按料液比1∶20(g/mL)添加雙水相溶液，于60℃溫度條件下超聲提取60min，總多酚提取率為3.04%。

參考文獻：

[1]劉塔斯, 裔秀琴. 四種大青葉的生藥研究[J]. 中藥材, 1986, 9(4)∶ 28-29.

[2]國家中醫藥管理局. 中華本草[M]. 上海∶ 上海科學技術出版社, 1999∶151-153.

[3]蔡文濤, 韓鳳梅. RP-HPLC測定穿心蓮、路邊青配伍藥液中脫水穿心蓮內酯在小鼠血漿中的濃度[J]. 湖北大學學報, 2005, 27(1)∶ 74-77.

[4]高玉瓊, 王恩源, 趙德剛, 等. 柔毛路邊青揮發性成分研究[J]. 生物技術, 2005, 15(2)∶ 52-54.

[5]歐陽玉祝, 陳小東, 唐紅玉, 等. 路邊青中總多酚的提取與分離研究[J]. 食品科學, 2009, 30(16)∶ 44-46.

[6]SHAHID I, SABA H, MUBEENA A, et al. Efficiency of pomegranate peel extracts in stabilization of sunflower oil under accelerated conditions [J]. Food Research International, 2008, 41(2)∶194-200 .

[7]LI Yunfeng, GUO Changjiang, YANG Jijun, et al. Evaluation of antioxidant properties of pomegranate peel extract in comparison with pomegranate pulp extract [J]. Food Chemistry, 2006, 96(2)∶ 254-260.

[8]KAKARLA P, VADLURI G, REDDY K S. Vulnerability of the mid aged rat myocardium to the age-induced oxidative stress∶ Influence of exercise training on antioxidant defense system[J]. Free Radical Research, 2005, 39(11)∶ 1211-1217.

[9]高雪麗, 高愿軍, 李建光, 等. 樺褐孔菌多酚對食用油脂的抗氧化效應研究[J]. 食品工業科技, 2008, 29(1)∶ 135-137.

[10]呂程麗, 歐陽玉祝, 林嶸, 等. 路邊青多酚提取液對花生油抗氧化性能的影響[J]. 食品與機械, 2009, 25(6)∶ 62-65.

[11]SUN R E, TOMKINSON J. Comparative study of lignins isolated byalkali and ultrasound assisted alkali extractions from wheat straw[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2002, 9(2)∶ 85-93.

[12]牛波, 邱海霞, 田景振, 等. 超聲強化提取技術[J]. 山東中醫雜志, 2000, 19(10)∶ 629-630.

[13]KARAKATSANISA A, LIAKOPOULOU-KYRIAKIDES M. Comparison of PEG/fractionated dextran and PEG/ industrial grade dextran aqueous two-phase systems for the enzymic hydrolysis of starch[J]. Journal of Food Engineering, 2007, 80(4)∶ 1213-1217.

[14]ZHI Wenbo, DENG Qiuyun. Purification of salvianolic acid B from the crude extract of Salvia miltiorrhiza with hydrophilic organic/salt-containing aqueous two-phase system by counter-current chromatography [J]. J Chromatogr A, 2006, 1116(1/2)∶ 149-152.

[15]DALLORA N L P, KLEMZ J G D, FILH P A P. Partitioning of model proteins in aqueous two-phase systems containing polyethylene glycol and ammonium carbamate[J]. Biochemical Engineering Journal, 2007, 34(1)∶ 92-97.

[16]LIU Xiaohai, GAOYuntao, TANG Runsheng, et al. On the extraction and separation of iodide complex of cadmium(Ⅱ) in propyl-alcohol ammonium sulfate aqueous biphasic system[J]. Separation & Purification Technology, 2006, 50(2)∶ 263-266.

[17]高云濤, 李干鵬, 李正全, 等. 超聲集成丙醇-硫酸銨雙水相體系從苦蕎麥苗中提取總黃酮及其抗氧化活性研究[J]. 食品科學, 2009, 30 (2)∶ 110-113.

Ultrasonic-assisted Two-phase Aqueous Extraction of Total Polyphenols from the Shoot of Geum japonicum Thunb. var. chinense F. Bolle

OUYANG Yu-zhu1,2，ZHANG Ci-hai2，XUE Hui2，WU Dao-hong2
(1. Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chemical Industry Engineering, Zhangjiajie 416000, China；2. Institute of Food Science, Jishou University, Jishou 416000, China)

The shoot of Geum japonicum Thunb. var. chinense F. Bolle was ultrasonified in ethanol-ammonium salt two-phase aqueous system to accelerate the extraction of total polyphenols. Operating parameters such as solid-to-liquid ratio, volume ratio of initial ethanol to initial water, temperature and extraction time were optimized by one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods for maximizing the extraction yield of total polyphenols. Solid-to-liquid ratio of 1∶20 (g/mL), volume ratio of initial ethanol to initial water of 0.8, ammonium sulfate concentration of 0.27g/mL, extraction temperature of 60 ℃ and extraction time of 60 min were found optimal. Under the optimal extraction conditions, the extraction yield of total polyphenols was 3.04%. This method can provide a novel approach for the extraction of total polyphenols with highly efficient, time-saving and energy-saving benefits and no impact on the biological activity of extracts.

two-phase aqueous system；ultrasonic；Geum japonicum Thunb. var. chinense F. Bolle；total polyphenols

TS201.2

A

1002-6630(2011)16-0089-04

2011-05-06

林產化工工程湖南省重點實驗室開放基金資助項目(JDZ201107)

歐陽玉祝(1956—)，男，教授，碩士，主要從事天然產品開發與功能食品研究。E-mail：ouyang1227@126.com