青錢柳愈傷組織總黃酮堿溶酸沉提取工藝

陳繼光，米麗雪，上官新晨*，李 翔，鐘世根

(江西農業大學食品科學與工程學院 天然產物研究與開發重點實驗室，江西 南昌 330045)

青錢柳愈傷組織總黃酮堿溶酸沉提取工藝

陳繼光，米麗雪，上官新晨*，李 翔，鐘世根

(江西農業大學食品科學與工程學院 天然產物研究與開發重點實驗室，江西 南昌 330045)

目的：研究以堿溶酸沉法提取青錢柳愈傷組織中的總黃酮。方法：采用堿溶酸沉法，對影響青錢柳愈傷組織中總黃酮提取的pH值、固液比、提取時間、硼砂用量等因素進行系統研究。結果：青錢柳愈傷組織中總黃酮堿提酸沉的最佳提取工藝為：采用固液比1∶20，堿提液pH9，硼砂含量2.5%，提取時間60min，酸沉pH 4.5。結論：在最佳提取工藝下，青錢柳愈傷組織中總黃酮得率達到4.01%。

青錢柳；愈傷組織；總黃酮；堿溶酸沉

青錢柳系雙子葉植物綱胡桃科青錢柳屬喬木植物，為我國特有[1]。研究表明[2-6]青錢柳含有豐富的天然藥用成分，如多糖、黃酮、酚類、植物蛋白、皂苷、香豆精、生物堿、甾體、萜類、苷類、有機酸、胡蘿卜素、VE、咖啡因等及一些人體必需的微量元素。《中國中藥資源志要》記載，其樹皮、葉具有清熱消腫、止痛的功能，可用于治療頑癬，長期以來民間用其葉片做茶[7]。李磊等[8-12]研究表明青錢柳嫩葉茶具有生津止渴、清熱解暑、降壓降脂血糖、增強機體免疫力及抗氧化防衰老的作用，可有效地用于防治糖尿病、高血壓、冠心病及神經衰弱等疾病。

黃酮類化合物分子中含有多個酚羥基，一般顯弱酸性，在堿性溶液中，黃酮類化合物易開環生成查耳酮型結構而多呈黃色、橙色或褐色，其機制是黃酮類化合物在堿性條件下苯并吡喃酮的1、2碳之間的C—O鍵開環成查耳酮型結構所致；在酸性條件下，查耳酮又恢復為閉環結構，黃色消失[13]。黃酮化合物經典的提取方法為有機溶劑提取法，尤其是醇提法。如董彩軍[14]采用乙醇-水作為提取劑提取青錢柳葉中黃酮類化合物，其總黃酮得率為22.04mg/g。堿溶酸沉法相對醇提取法提取率稍低，但堿溶酸沉法具有工藝、設備簡單，操作方便，產品安全，無環境污染，不使用有機溶劑，生產成本低等優點。劉金香等[15]利用堿溶酸沉法提取銀杏葉總黃酮，使銀杏葉總黃酮的提取率達到86.4%。目前，青錢柳愈傷組織中總黃酮的提取未見文獻報道，筆者在超聲條件下采用堿提酸沉法對青錢柳愈傷組織總黃酮進行提取并測定總黃酮得率，并確定了提取工藝的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將青錢柳葉子接于附加0.5mg/L NAA和1.0mg/L 6-BA的MS培養基，于溫度25℃，光強2000lx，黑暗培養7～10d后，再進行光暗交替12h/12h的條件下培養誘導青錢柳愈傷組織。

形成的愈傷組織繼代培養于含30mL固體培養基的100mL的培養瓶中，MS＋0.3mg/L 2,4-D＋0.5mg/L KT＋3%蔗糖的培養基上，2周繼代1次。在晝夜溫度25℃，光強2000lx，光暗交替12h/12h的條件下培養。

氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、正丁醇、乙酸乙脂、9 5%乙醇、四硼酸鈉、鹽酸、氧化鈣等均為市售分析純；蘆丁 中國藥品生物制品檢定所。

1.2 儀器與設備

KQ3200DB數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；QT-1旋渦混合器 上海琪特分析儀器有限公司；754型PC紫外可見分光光度計、光譜723型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

將收獲的愈傷組織，去除底部瓊脂，60℃烘干至恒質量，研磨后過100目篩網，裝入密封袋放入干燥器中備用。

1.3.2 標準溶液制備

精密稱取1 2 0℃干燥至質量恒定的蘆丁標準品10mg，加80%乙醇溶解，定容，搖勻，即得質量濃度為0.2mg/mL蘆丁標準液。

1.3.3 最大吸收峰的確定

精密量取蘆丁標準液和樣品液各2mL，加入質量分數5% NaNO2溶液0.3mL后，靜置6min，加質量分數10% Al(NO3)3溶液0.3mL，靜置6min后，再加入濃度1mol/L NaOH溶液4mL，分別用60%乙醇定容至10mL，搖勻，放置15min，用紫外可見分光光度計在400～700nm進行全波長掃描，最大吸收峰在503nm處。

1.3.4 標準曲線的繪制

圖1 蘆丁的標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

精密吸取標品質量濃度0.2mg/mL標準品溶液0、0.5、1.5、2、2.5、3、3.5、4mL，分別置于10mL試管中，加5% NaNO20.3mL，放置6min后，加10% Al(NO3)30.3mL，放置6min，再加4%氫氧化鈉4mL，加水定容到10mL并搖勻，放置15min。根據最大吸收波長做標準曲線，不同質量濃度下的吸光度經最小二乘法作線性回歸，得回歸方程C＝0.1009A＋0.0005，R2＝0.996。

1.3.5 青錢柳愈傷組織總黃酮提取

精密稱取500mg粉末于具塞試管中，加入3.5%硼砂，加入10mL pH9.0的飽和石灰水在60℃超聲提取1h，抽濾后將濾液pH值調至4.5，將調好酸后的提取液加入10mL乙酸乙酯、正丁醇分別萃取2次。將乙酸乙酯萃取液與正丁醇萃取液合并，旋轉蒸干，加入一定量95%乙醇，超聲溶解，并定容于10mL容量瓶中，待測液制好備用。

1.3.6 青錢柳組織細胞培養物中總黃酮得率測定

用NaNO2-Al(NO3)3比色體系檢測青錢柳愈傷組織中總黃酮的得率。取0.1mL上述方法制備好的待測液于10mL具塞試管中按照標準品的顯色方法處理，測定其吸光度，并代入回歸方程計算樣品中的總黃酮得率。實驗均重復3次，結果取平均值。

式中：M為青錢柳組織細胞培養物干粉的質量/mg；A為吸光度；V為提取后定容的體積/mL；

1.3.7 數據處理

數據統計分析采用DPS數據處理系統，V6.55專業版。

2 結果與分析

2.1 固液比對青錢柳組織培養物中總黃酮得率的影響

在60℃、硼砂用量3.5%、石灰水pH9.0、超聲提取時間60min、酸沉pH4.5的條件下，選取固液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40，考察固液比對青錢柳愈傷組織總黃酮得率的影響，不同固液比的提取結果見圖2。

圖2 固液比對青錢柳組織培養物中總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus

由圖2可知，當固液比小于1∶20時，得率較低，而隨著固液比的增大，青錢柳愈傷組織中總黃酮得率增大，且在1∶20時到達最大為4.06%；固液比大于1∶20時，總黃酮得率趨于平緩下降。這可能是由于固液比增大可以增加物料與溶劑的接觸面積，使得黃酮類物質在更充分的溶解出來的同時也被部分水解[16]，所以確定最佳固液比為1∶20。

2.2 不同堿性提取液pH值對青錢柳組織培養物中總黃酮得率的影響

由于青錢柳黃酮類化合物含有酚羥基，具有弱酸性。因此提高提取溶劑的堿性對提取有利。用稀鹽酸溶液調氫氧化鈣溶液pH值分別為8.0、9.0、10.0、11.0、12.0進行實驗，結果如圖3所示。

圖3 堿性提取液pH值對青錢柳組織培養物中總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction pH value on extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus

由圖3可知，隨著pH值增大，試樣中黃酮得率增加，而后又減小，在pH10.0時，黃酮得率達到最大為4.03%。因青錢柳葉片所含黃酮類物質主要是山萘酚、槲皮素、異鼠李素等苷類化合物[17]，其結構均含有多個酚羥基，呈一定酸性，與稀Ca(OH)2溶液反應，可生成易溶于水的鹽類，因此，堿用量增加，pH值增大，黃酮類物質溶解量增多，提取液中黃酮得率相應提高。但如堿液濃度過高或溶液pH值過大，黃酮母核遭到破壞，而致黃酮得率下降。

2.3 硼砂用量對青錢柳組織培養物中總黃酮得率的影響

圖4 硼砂用量對青錢柳組織培養物中總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of borax amount on extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus

青錢柳總黃酮分子中含有鄰二酚羥基，在空氣中易被光分解而變為暗褐色，在堿性條件下更易被氧化分解，硼酸鹽能與鄰二酚羥基結合而達到保護的目的，因此在用堿液加熱提取黃酮時，往往加入少量硼砂作為保護試劑以減少其所含黃酮類化合物氧化分解。

由圖4可知，總黃酮得率隨硼砂用量的增加呈先增加后減小的趨勢，當硼砂質量分數為2.5%時，總黃酮得率達到最大值為3.65%。因此，選擇硼砂含量為2.5%可達較好的提取效果。

2.4 提取時間對青錢柳組織培養物中總黃酮得率的影響

圖5 提取時間對青錢柳組織培養物中總黃酮得率的影響Fig. 5 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus

從圖5可以看出，隨著提取時間的增加總黃酮得率也增加，但時間達到60min時，黃酮得率最高為3.78%。隨著時間的增加，得率反而下降，這可能是因為隨著提取時間的增加，黃酮類物質發生氧化、分解而導致得率下降。另外，媒質里的其他雜質也大量溶出使總黃酮百分含量下降，同時也增加能耗。

2.5 酸沉pH值對青錢柳組織培養物中總黃酮提取得率的影響

圖6 酸沉pH值對青錢組織培養物中總黃酮得率的影響Fig. 6 Effect of acid precipitation pH value on extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus

為了盡可能回收黃酮類化合物，用稀HCl溶液將堿性石灰水提取液調節pH值分別為1.5、2.5、3.5、4.5、5.5。由圖6可看出，在酸性范圍內，隨酸度減小，樣品中黃酮類化合物含量隨之增加，而后酸度再減小其含量也隨之減小，在pH4.5時，達到最高為3.93%。由于黃酮類化合物可溶于堿性溶液，加酸時又沉淀析出，故隨酸度增大，黃酮類物質析出量相應增多。但因黃酮母核中吡喃環上的氧原子有一定堿性，在酸性較強時，易形成鹽而溶解，導致部分黃酮損失。

2.6 堿提酸沉法提取青錢柳組織培養物中總黃酮的正交試驗設計

表1 L9(34)青錢柳愈傷組織提取正交試驗設計及結果Table 1 Orthogonal array design and results for optimal extraction of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus

表2 黃酮得率正交試驗結果方差分析Table 2 Variance analysis for extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus with various process conditions

表3 Duncan新復極差法多重比較Table 3 Duncan multiple comparison of total flavonoids extraction rate

參考單因素試驗結果，以石灰水溶液為提取劑，選取堿性提取液pH值、硼砂用量及提取時間、酸沉pH值4個因素為考察因素，以青錢柳愈傷組織中總黃酮得率為指標，確定各正交設計因素的水平，按L9(34)正交表對堿法提取工藝進行研究，確定青錢柳愈傷組織總黃酮堿法提取的最佳工藝參數。正交試驗設計與結果見表1，利用DPS軟件通過極差分析、方差分析和Duncan新復極差法多重比較，優選出堿提酸沉法提取青錢柳組織中總黃酮的最佳工藝參數。正交試驗設計的各因素水平及結果見表1。

從表1數據分析結果可知，影響青錢柳愈傷組織中總黃酮得率各因素主次關系為：D＞B＞C＞A。其中硼砂含量、酸沉pH值和提取時間對青錢柳愈傷組織中總黃酮得率影響極顯著，堿液pH值對青錢柳愈傷組織中總黃酮提取影響不顯著。因此，綜合極差和Duncan分析結果，得到青錢柳愈傷組織中總黃酮提取最優工藝參數為A1B2C2D2，即堿液pH9、硼砂含量2.5%、提取時間60min、酸沉pH4.5。

2.7 提取次數和重現性實驗

在正交優化條件下分別做提取次數實驗和重現性實驗，確定提取級數對青錢柳組織培養物中總黃酮得率的影響和優化條件的可行性和重現性。

表4 提取次數實驗結果Table 4 Effect of repeated extraction number on extraction rate of total flavonoids

表5 重復性實驗結果Table 5 Results of reproducibility experiments

表4浸提次數結果表明，第1次浸提的青錢柳愈傷組織中總黃酮提取率之和占3次浸提提取率總和的97.4%，從節約浸提成本的角度考慮，采用一級浸提。表5結果表明，正交優化條件下提取試驗的重現性較好(RSD＝2.26%)，黃酮得率達4.01%。

3 結 論

本實驗應用超聲輔助技術，采用堿液提取法提取青錢柳組織細胞培養物中的總黃酮，通過單因素和正交試驗，確定了堿提酸沉法提取青錢柳愈傷組織總黃酮的最佳提取條件為：固液比1∶20、堿液pH9、硼砂含量2.5%、提取時間60min、酸沉pH4.5，在此條件下青錢柳愈傷組織中總黃酮得率為4.01%。采用此法，總黃酮得率較高，且使用水為提取溶劑，具有成本低、污染性小等特點．具有較高的實用價值。

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Optimization of Alkali Extraction and Acid Precipitation Process for Total Flavonoids from Cyclocarya paliurus Callus

CHEN Ji-guang，MI Li-xue，SHANGGUAN Xin-chen*，LI Xiang，ZHONG Shi-gen
(Key Laboratory of Natural Products Research and Development, College of Food Science and Engineering, Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China)

Objective∶ To optimize the alkali extraction and acid precipitation of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus. Methods∶ The effects of pH, material/liquid ratio, borax amount and extraction time on the extraction rate of total flavonoids from Cyclocarya paliurus callus. Results∶ The optimal extraction conditions were extraction solvent pH of 9.0, borax amount of 2.5%, extraction time of 60 min, and acid precipitation pH of 4.5. Conclusion∶ Under the optimal conditions, the extraction rate of total flavonoids was up to 4.01%.

Cyclocarya paliurus；callus；total flavonoids；alkali extraction and acid precipitation

S336；O623.59

A

1002-6630(2011)16-0103-05

2010-10-29

江西省主要學科學術和技術帶頭人項目(2009DD00900)；江西省科技廳支撐項目(2009BSB09100)

陳繼光(1985—)，男，碩士研究生，研究方向為植物資源利用開發。E-mail：chenjiguang1@126.com

*通信作者：上官新晨(1962—)，男，教授，博士，研究方向為天然產物研究與開發。E-mail：shangguanxc_818@sina.com