柿果多酚提取工藝優化

周 舟，曾建國，彭 淼，鐘曉紅,*，李良導，劉 婷

(1.湖南農業大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學東方科技學院，湖南 長沙 410128)

柿果多酚提取工藝優化

周 舟1，曾建國1，彭 淼2，鐘曉紅1,*，李良導2，劉 婷1

(1.湖南農業大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128；2.湖南農業大學東方科技學院，湖南 長沙 410128)

采用單因素試驗設計，研究乙醇體積分數、料液比、提取時間和提取溫度4個因素對柿果總酚及縮合多酚超聲提取效果的影響，并采用正交試驗設計對提取工藝進行優化。結果表明影響因素對提取效率影響順序為：乙醇體積分數＞料液比＞提取時間＞提取溫度。最佳提取條件為：乙醇體積分數90%、料液比1∶40(g/mL)、時間30min、提取溫度40℃，在此條件下進行驗證實驗，總酚提取率為2.061%。

柿；果實多酚；縮合多酚；提取

柿(Diospyros kaki L.)，為柿樹科柿屬植物，世界上柿科植物有Diospyros L.、Euclea L.、Lissocarpa Bentn.3個屬共500余種[1]。柿原產于我國長江流域，我國也是世界上最大的柿樹種植國。果實營養豐富，風味獨特，具有很高的食用和經濟價值及醫療保健效果，歷來深受人們的喜愛[2-3]。我國柿品種繁多，一般根據柿果澀味的差別，將柿品種分為完全澀柿(pollination contentas astring，PCA)，不完全澀柿(pollination variant astringent，PVA)，不完全甜柿(pollination variant nonastringent，PVNA)和完全甜柿(pollination content nonastringent，PCNA)，其中澀柿類品種柿果采收后有澀味，需人工脫澀后方可食用，我國所產的品種多屬澀柿類[4]。研究表明，柿果中含有大量的多酚類物質，且柿果中的多酚主要為縮合多酚，具有抑制人淋巴細胞白血病、降血壓、抗氧化性、清除自由基以及抑制蛇毒等多種功能[5-9]。目前，對柿的研究主要集中在柿樹栽培、柿果脫澀及貯藏等方面，對于柿果多酚的提取和綜合利用的研究還比較少。本實驗根據單因素試驗設計和正交試驗設計對柿果多酚超聲輔助提取進行優化，以期為柿果多酚的綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試品種為長沙牛心柿，2010年7月采自湖南農業大學果園，于柿樹朝陰、陽面，樹冠內外以及樹干高低處采集發育正常的柿果；福林酚試劑、原花青素標準品 美國Sigma公司；沒食子酸、香草醛、無水碳酸鈉、乙醇、丙酮、甲醇、鹽酸。

U-3310紫外可見光分光光度計 日本Hitachi公司；組織搗碎勻漿機 上海帥佳電子科技有限公司；超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取溶劑的選擇

對乙醇、甲醇和丙酮3種溶劑提取時柿果中總酚和縮合多酚的提取效果進行考察，以確定合適的提取溶劑。采用50%、60%、70%、80%、90%體積分數對3種溶劑進行對比分析。

1.2.2 單因素試驗

選取料液比(柿果鮮質量與不同乙醇體積分數之比，g/mL)、提取時間和提取溫度3個可能影響提取效果的因素，以總酚和縮合多酚含量為檢測指標進行單因素試驗，以確定相關因素及各因素的適宜范圍。各因素水平如下：料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30；超聲時間10、20、30、40min；超聲溫度30、40、50、60℃。

1.2.3 柿果多酚提取正交試驗

根據溶劑選擇實驗以及單因素試驗確定的范圍，選定乙醇體積分數、料液比、提取時間和提取溫度4個主要影響因素進行正交試驗以確定最佳提取工藝條件，正交試驗設計見表1。

表1 L9(34)正交試驗因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in orthogonal array design

1.2.4 提取方法

將柿青果淋洗晾干，切塊，去皮后在搗碎機中搗碎后備用，準確稱取2.5g，按照單因素和正交試驗中設置的不同提取條件分別進行超聲輔助提取。收集各個提取條件下得到的提取液，抽濾得濾液，減壓濃縮，濃縮液用提取溶劑定容至100mL備用，每個處理重復3次。

1.2.5 總酚(total polyphenols，TP)含量的測定

參照文獻[10]中的測定方法，繪制沒食子酸標準曲線，得吸光度(A)與沒食子酸標準溶液質量濃度(C，mg/mL)之間的回歸方程為A=72.371C＋0.0364，R2=0.9988。精密量取不同處理條件下制得的樣品液0.1mL于10mL容量瓶中，定容，測定其吸光度，按照標準曲線計算出柿果多酚質量濃度(C，mg/mL)，之后計算出總酚含量。

1.2.6 縮合多酚(condensed polyphenols，CP)含量測定

參照文獻[11]中的測定方法，繪制原花青素標準曲線，得吸光度(A)與原花青素標準溶液質量濃度(C，mg/mL)之間的回歸方程為A=8.2600C-0.0268，R2=0.9983。精密量取不同處理條件下制得的樣品液0.1mL于10mL容量瓶中，定容，測定其吸光度，按照標準曲線計算出柿果縮合多酚質量濃度(C，mg/mL)，之后計算出縮合多酚含量。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

常用多酚類物質的提取劑有乙醇、甲醇及丙酮等，在柿成熟果果肉的提取中發現乙醇作為提取劑時溶出較多的雜質常常使得過濾變得困難，不利于實驗的后續處理，而甲醇、丙酮的過濾效果較好[12]。但是通過實驗發現，在柿青果果肉的提取中則過濾比較順利。柿果去皮后搗碎備用，同時稱取2.5g，分別選用50%、60%、70%、80%、90%丙酮以及50%、60%、70%、80%、90%甲醇溶液和50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液，按料液比1∶40于40℃超聲提取30min，測定總酚以及縮合多酚的含量。

圖1 不同溶劑對總酚提取的影響Fig.1 Effects of different solvents on extraction rate of total polyphenols

從圖1、2可以看出，甲醇的提取效果較其他兩種試劑要好，但是差別不大。與此同時，由于本研究將被運用到工藝生產中生產日化產品，考慮到安全因素，故選定乙醇作為提取溶劑。在以縮合多酚作為考察指標時可以看出乙醇體積分數越高提取效果越好，最終選定90%乙醇溶液作為提取溶劑。

圖2 不同溶劑對縮合多酚提取的影響Fig.2 Effects of different solvents on extraction rate of condensed polyphenols

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 料液比對提取效果的影響

稱取2.5g搗碎后的柿果備用材料，在相同的實驗條件下(以90%乙醇作為提取溶劑、超聲溫度40℃、超聲時間30min)分別按1∶15、1∶20、1∶25、1∶30料液比超聲提取，過濾得提取液，定容后，測定提取液總酚及其縮合多酚含量(圖3)。結果表明：總酚和縮合多酚的提取量隨著料液比增大而逐漸增大，至1∶30時基本達到平衡，故料液比以1∶30為宜。

圖3 料液比對總酚和縮合多酚提取的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of total polyphenols and condensed polyphenols

2.2.2 超聲時間對提取效果的影響

圖4 時間對總酚和縮合多酚提取的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on extraction rate of total polyphenols and condensed polyphenols

料液比1∶30，其他條件同2.2.1節，分別按10、20、30、40min超聲時間超聲提取。過濾提取液，定容后，測定提取液總酚及其縮合多酚含量(圖4)。結果表明：總酚和縮合多酚的提取量隨著超聲時間的增加逐漸增加，在超聲30min時達到最大值，之后開始下降。故超聲時間以30min為宜。

2.2.3 超聲溫度對提取效果的影響

超聲時間30min，其他條件同2.2.2節，分別在30、40、50、60℃超聲提取。過濾提取液，定容后，測定提取液總酚及其縮合多酚含量(圖5)。結果表明：總酚的提取量隨著超聲溫度的升高在40℃時達到最大值，之后逐漸下降。縮合多酚的提取量則是在50℃時達到最大值才下降。

圖5 時間對總酚和縮合多酚提取的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of total polyphenols and condensed polyphenols

2.3 柿果多酚正交試驗結果

表2 柿果多酚提取工藝正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design and corresponding experimental results %

表3 以縮合多酚為目標產物的正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis for extraction rate of condensed polyphenols with various extraction conditions

根據表2極差分析可知：提取總酚的最佳條件為乙醇體積分數80%、料液比1∶40、時間30min、提取溫度4 0℃；提取縮合多酚的最佳條件為乙醇體積分數90%、料液比1∶40、時間30min、提取溫度40℃。兩組數據中極差值最大為A(乙醇體積分數)，B(料液比)和C(提取時間)次之，D(提取溫度)最小。說明乙醇體積分數是影響多酚提取效果的主要因素，料液比和提取時間也有一定的影響，而提取溫度影響較小。由表3、4方差分析可知，以總酚為檢測指標時，乙醇體積分數和料液比有顯著影響，提取時間和提取溫度沒有顯著影響；以縮合多酚為檢測指標時，乙醇體積分數有極顯著影響，料液比有顯著影響，提取時間和提取溫度無顯著影響。綜合單因素試驗以及正交試驗結果，以總酚為主要指標分析其中縮合多酚含量，選定柿果多酚提取的最佳條件為乙醇體積分數90%、料液比1∶40、時間30min、提取溫度40℃。

表4 以總酚為目標產物的正交試驗方差分析Table 4 Variance analysis for results of orthogonal experiments of total polyphenol

3 結 論

通過單因素和正交試驗結果分析表明，本實驗選擇的4個因素對多酚提取的影響差別較大，順序為乙醇體積分數＞料液比＞提取時間＞提取溫度。其中乙醇體積分數對柿果總酚和縮合多酚的提取影響較大，而溫度影響最小，而且通過單因素試驗可以看出，溫度越高對提取效果越不利，這可能是由于多酚在高溫環境下不穩定導致[13]，而且當提取溫度比較高時，得到的提取液呈紅色，這應該是由酚類化合物的自縮合反應所致[6,14]；柿果多酚中以沒食子酸為主[15]，而沒食子酸不溶于冷水。因此，最佳提取條件為90%乙醇體積分數、料液比為1∶40、40℃超聲提取30min。

[1]傍島善次. 柿和人生[M]. 東京∶ 明玄書房, 1980∶ 1445.

[2]馬麗. 柿樹產品的開發利用[J]. 林產化工通訊, 2004, 38(3)∶ 38-40.

[3]SHELA G, ZOFIA Z, MARIA F, et al. Comparative contents of dietary fiber, total phenolics, and Minerals in persimmons and apples[J]. Food Chemistry, 2001, 49(2)∶ 952-957.

[4]宗學普. 柿樹栽培技術[M]. 北京∶ 金盾出版社, 2000∶ 135-138.

[5]WU Paiwen, HWANG L S. Determination of soluble persimmon tannin by high performance gel permeation chromatography[J]. Food Research International, 2002, 35(8)∶ 793-800.

[6]GU Haifeng, LI Chunmei, XU Yujuan, et al. Structural features and antioxidant activity of tannin from persimmon pulp[J]. Food Research International, 2008, 41(2)∶ 208-217.

[7]AHN H S, JEONA T I, LEEA J Y, et al. Antioxidative activity of persimmon and grape seedextract∶ in vitro and in vivo[J]. Nutrition Research, 2002, 22(11)∶ 1265-1273.

[8]Del BUBBA M, GIORDANI E, PIPPUCCI L, et al. Changes in tannins, ascorbic acid and sugar content in astringent persimmons during on-tree growth and ripening and in response to different postharvest treatments [J]. Food Composition and Analysis, 2009, 22(7/8)∶ 668-677.

[9]DOWDLE J, ISHIKAWA T, GATZEK S, et al. Two genes in Arabidopsis thaliana encoding GDP-1-galactose phosphorylase are required for ascorbate biosynthesis and seedling viability[J]. The Plant Journal, 2007, 52 (4)∶ 673-689.

[10]徐金瑞, 張名位, 劉興華, 等. 黑大豆種質抗氧化能力及其與總酚和花色昔含量的關系[J]. 中國農業科學, 2006, 39(8)∶ 1545-1552.

[11]李春陽, 許時嬰, 王璋, 等. 香草醛-鹽酸法測定葡萄籽、梗中原花青素含量的研究[J]. 食品科學, 2004, 25(2)∶ 157-162.

[12]顧海峰, 李春美, 鐘慧臻, 等. 柿子單寧優化提取工藝探討[J]. 食品科技, 2007, 32(2)∶ 133-136.

[13]張東明. 酚酸化學[M]. 北京∶ 化學工業出版社, 2008∶ 107-108.

[14]石碧, 狄瑩. 植物多酚[M]. 北京∶ 科學出版社, 2000∶ 58.

[15]費學謙, 周立紅, 龔榜初, 等. 不同甘、澀類型柿果實單寧組成的差異及羅田甜柿單寧的特性[J]. 林業科學研究, 1999, 12(4)∶369-373.

Optimization of Extraction Process for Polyphenols from Persimmon Fruits

ZHOU Zhou1，ZENG Jian-guo1，PENG Miao2，ZHONG Xiao-hong1,*，LI Liang-dao2，LIU Ting1
(1. College of Horticulture and Gardening, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China；2. Orient Science and Technology College, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Solvent extraction was used to extract polyphenols from persimmon fruits in this study. Among three organic solvent investigated, ethanol was found to be the most suitable solvent for extracting total polyphenols and condensed polyphenols from persimmon fruits. The following investigations were carried out to explore the effects of ethanol concentration, materialto-liquid ratio, extraction time and extraction temperature on total polyphenol yield and to optimize the four process conditions by one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. Ethanol concentration was identified as the most important factor that affects total polyphenol yield followed by material-to-liquid ratio, extraction time and extraction temperature. The optimal extraction conditions for achieving both higher yields of total polyphenols and condensed polyphenols from persimmon fruits were ethanol concentration of 90%, material-to-liquid ratio of 1∶40, extraction time of 30 min and extraction temperature of 40 ℃. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of total polyphenols was up to 2.061%.

persimmon；total polyphenols；condensed polyphenols；extraction

TS201.1

A

1002-6630(2011)16-0117-04

2010-11-26

周舟(1984—)，男，碩士研究生，研究方向為藥用植物高值化利用。E-mail：121372@163.com

*通信作者：鐘曉紅(1961—)，女，教授，博士，研究方向為園藝和中藥資源開發與利用。E-mail：xh-zhong@163.com