食品中3種致病菌多重PCR檢測體系的建立及初步應用

錢志偉，孫新城

(1.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院食品科學系，河南 鄭州 4 51450；2.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002)

食品中3種致病菌多重PCR檢測體系的建立及初步應用

錢志偉1，孫新城2

(1.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院食品科學系，河南 鄭州 4 51450；2.鄭州輕工業(yè)學院食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002)

目的：建立同步速測食品中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生性李斯特菌的多重聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)方法。方法：利用基因組比對法尋找3種致病菌的特異性序列——沙門氏菌的invA基因、金黃色葡萄球菌的nuc基因和單增李斯特菌的prs基因，運用Primer Premier 5.0分別設計3對片段大小不同的特異性引物；通過優(yōu)化反應體系，建立3種致病菌的多重PCR檢測體系。結果：建立的多重PCR方法靈敏度測試結果分別為7.6、3.8、5.1pg/μL，在此靈敏度下可以擴增出全部特異性引物條帶，驗證性實驗結果出現(xiàn)相應的目的條帶且未發(fā)生交叉影響。結論：初步建立能同步、簡便、快速、靈敏地檢測食品中沙門菌、金黃色葡萄球菌和單核細胞增生性李斯特菌的三重PCR方法。

食源性致病菌；多重聚合酶鏈式反應(PCR)；沙門氏菌；金黃色葡萄球菌；單核細胞增生性李斯特菌；食品檢測

近年來，國內(nèi)外食品安全事件頻頻發(fā)生，其中由于病原微生物污染導致的食源性疾病最為常見。有資料統(tǒng)計，近10年來，在我國由微生物引起的食源性疾病事件中，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌分別占17.9%和8.9%。在我國70%～80%的細菌食物中毒是由沙門氏菌引起的。單核細胞增生性李斯特菌污染食品引起的惡性中毒事件，在美國、墨西哥、法國多次發(fā)生，病死率達30%～70%[1-3]。因此，研究快速有效的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單核細胞增生性李斯特菌檢測和監(jiān)控方法，對于保證食品安全有著重要的意義。

傳統(tǒng)的致病菌檢驗，主要依靠常規(guī)的細菌學培養(yǎng)，存在著檢驗步驟繁瑣，周期長、特異性不強、靈敏度不高等問題，而且每次只能檢測出一種致病菌。有關致病菌檢測的乳膠凝集法、酶免疫測定法、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA)、聚合酶鏈式反應技術(polymerase chain reaction，PCR)、核酸雜交技術和生物傳感器技術因其特異性強、敏感性高、操作簡單快速得到廣泛應用，但這些方法每次實驗通常也只能檢測一種病原細菌[4-5]，而食品通常存在多種病原菌多重混合污染，因此，近年來出現(xiàn)了許多同時檢測多種致病菌的快速和特異的檢測方法，多重PCR就是其中的一種[6]。多重PCR是在常規(guī)PCR基礎上改進并發(fā)展起來的新型DNA擴增技術，是在同一反應體系中同時加入多對引物，并對多個特異性目的基因片段進行同時擴增，可對檢測對象中的多種細菌進行同步檢測[7-9]。目前，針對對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單核細胞增生性李斯特菌快速檢測的現(xiàn)有報道中大多為單重擴增或單個致病菌的多重擴增，尚未見這3種致病同步檢測的報道[10-15]。

本研究分別以沙門氏菌的invA基因、金黃色葡萄球菌的nuc基因和單增李斯特菌的prs基因為靶基因，建立起同時檢測食品中沙門菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的多重PCR檢測方法，為食品中多種致病菌的快速檢測提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157∶H7 河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院食品科學系；乙型副傷寒沙門氏菌、單核細胞增生性李斯特菌、志賀氏菌、乙型溶血性鏈球菌由河南農(nóng)業(yè)大學和鄭州大學惠贈。

DNA提取試劑盒、DL2000 DNA Ladder Marker、核酸回收試劑盒 TaKara寶生物工程(大連)有限公司；Taq酶、10×Buffer 美國Promega生物公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

Eppendorf 離心機、PTC200梯度PCR儀、電泳儀美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 靶基因的選擇及引物設計

選擇3種致病菌的特異性保守基因[16-18]，即沙門氏菌的invA基因、金黃色葡萄球菌的nuc基因和單增李斯特菌的prs基因作為目的基因，用Primer Premier 5.0軟件分別設計3對片段大小不同、退火溫度接近的特異性引物，經(jīng)過GenBank的BLAST程序對各引物及擴增產(chǎn)物同源性進行比對，確認引物序列見表1。

表1 多重PCR引物序列Table 1 Sequences of multiple PCR primers

1.2.2 菌株培養(yǎng)與基因組DNA的提取

分別挑取沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌單菌落接種于LB培養(yǎng)基，37℃振蕩過夜培養(yǎng)。基因組DNA的抽提采用DNA提取試劑盒，按其操作說明進行。用紫外分光光度計測定濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單重PCR檢測體系的建立

分別以3種菌株的基因組DNA為模板，進行單重PCR，擴增體系及參數(shù)：10×Buffer 2.5μL，25mmol Mg2+1.5μL，10mmol dNTP 0.3μL，50pmol的上下游引物0.1μL 5U/μL Taq酶0.5μL。94℃預變性5min后進入循環(huán)，94℃ 50 s、53℃ 50 s、72℃ 50 s，35個循環(huán)，72℃延伸5min。擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.4 引物特異性驗證

用3種引物分別擴增枯草芽孢桿菌、大腸桿菌O157∶H7、乙型副傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、乙型溶血性鏈球菌的基因組DNA，用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.5 三重PCR檢測體系建立及優(yōu)化

采用正交設計L16(44)在4個水平上進行試驗來確定PCR反應中4個因素(Taq酶、dNTPS、Mg2+、引物)的最佳水平，根據(jù)條帶的模糊程度、亮度差別以及含量，確定最佳多重PCR檢測體系。

1.2.6 三重PCR靈敏性驗證

將已測定濃度的3種菌的基因組DNA按10-1～10-5梯度進行10倍稀釋后等體積混合，在最佳的多重PCR體系下進行擴增，觀察多重PCR擴增的靈敏度。

1.2.7 人工模擬牛奶中3種菌檢測

分別將3株致病菌過夜培養(yǎng)，利用平板傾注法計數(shù)后，將3種菌組合感染(感染量約為1×107CFU/mL)牛奶，試劑盒提取DNA，用優(yōu)化好的PCR體系檢測。

2 結果與分析

2.1 模板DNA的初始濃度及純度

用紫外分光光度計分別檢測3種菌基因組DNA在260nm和280nm波長處的OD值，OD260/OD280都在1.7～1.8之間，純度達到要求；初始質(zhì)量濃度：沙門氏菌7.6μg/mL，金黃色葡萄球菌 3.8μg/mL，單增李斯特菌5.1μg/mL。

2.2 單重PCR擴增

3種致病菌基因組DNA經(jīng)過單重PCR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，均擴出目的條帶，擴增產(chǎn)物回收經(jīng)上海生工測序，測序結果用DNA s ister軟件分析和GenBank的BLAST 比對程序進行比對，與GenBank上公布的序列相似性很高(99%)，說明此次擴增的目的基因，引物特異性強。擴增圖見圖1。

圖1 單重PCR擴增實驗結果Fig.1 Results of single PCR amplification

2.3 引物特異性驗證

圖2 特異性驗證實驗結果Fig.2 Specificity of the primers of Salmonella spp., Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes

用3種引物分別擴增其他5種致病菌的基因組DNA，用引物相對應的基因組DNA做陽性對照，無菌生理鹽水做陰性對照。只有陽性對照擴增出目的片段，其他5種致病菌沒有擴增出目的片段，說明3對引物特異性較好。擴增結果見圖2。

2.4 多重PCR檢測體系建立

通過正交試驗L16(44)，確定25mmol Mg2+1.2μL，10mmol dNTPS 0.6μL，50pmol的上下游引物 0.2μL，5U/μL Taq酶1.5μL為最優(yōu)條件。最優(yōu)條件擴增結果見圖3。

圖3 多重PCR擴增實驗結果Fig.3 Results of multiplex PCR amplification

2.5 多重PCR靈敏性驗證

分別將10倍梯度稀釋的3種食源性致病菌的基因組DNA等體積混合，用優(yōu)化的多重PCR體系進行擴增檢測，3種菌分別能檢測到：沙門氏菌7.6pg/μL，金黃色葡萄球菌3.8pg/μL，單增李斯特菌5.1pg/μL。本方法研究的多重PCR靈敏度為101pg，在此靈敏度下可以擴增出全部特異性引物條帶，結果如圖4所示。

圖4 多重PCR的靈敏度實驗結果Fig.4 Sensitivity of the multiplex PCR method

2.6 模擬實驗驗證

3種食源性致病菌組合后人工感染牛奶，進行多重PCR檢測，結果出現(xiàn)相應的目的條帶并且未發(fā)生交叉影響，從而證明該多重PCR檢測體系具有較好的穩(wěn)定性和一定的實用價值，結果如圖5所示。

圖5 多重PCR的驗證實驗結果Fig.5 Validation of the multiplex PCR method

3 討 論

多重PCR是在單重PCR基礎發(fā)展起來的檢測方法，它在同一反應中使用多套引物同時擴增多種待測靶基因。應用多重PCR技術檢測致病菌基因，簡化了單重PCR研究所需要的繁雜的實驗操作，使得一次反應檢測多個項目成為可能，目前該技術已被廣泛的用于食品中致病菌的檢測。

目的基因的篩選對PCR的特異性非常重要，同時由于不同引物之間的解鏈溫度不同，所以找到一個適合所有引物的解鏈溫度在多重PCR中也顯得十分重要。所以本研究選取沙門氏菌的invA基因、金黃色葡萄球菌的nuc基因和單增李斯特菌的prs基因作為目的基因來設計引物，這3個序列均為目的菌的高度保守序列，特異性強，可作為基因檢測和鑒定的依據(jù)。

多重PCR擴增時，任何一種試驗條件控制不當，都將很容易導致非特異性的產(chǎn)物甚至擴增失敗[19-21]。本研究通過設計在一定范圍內(nèi)的L16(44)正交試驗優(yōu)化了多重PCR反應體系，找到合適的配比關系，實現(xiàn)了3種病原菌的同時檢測。

本研究建立的多重PCR檢測方法，可同時檢測食源性致病菌沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌，同時擴增出3條大小不同的目的片段，并且有很強的特異性；而且快速準確、簡便、靈敏度高；可為進入實際臨床檢測提供理論基礎和技術支持，具有一定的應用價值。

[1]劉秀英. 全球食源性疾病現(xiàn)狀[J]. 國外醫(yī)學∶ 衛(wèi)生學分冊, 2003, 30 (4)∶ 199-206.

[2]毛雪丹, 胡俊峰, 劉秀梅. 2003—2007年中國1060起細菌性食源性疾病流行病學特征分析[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2010, 22(3)∶ 224-228.

[3]索玉娟, 于宏偉, 凌巍, 等. 食品中金黃色葡萄球菌污染狀況研究[J].中國食品學報, 2008, 8(3)∶ 88-93.

[4]王大勇, 方振東, 謝朝新, 等. 食源性致病菌快速檢測技術研究進展[J]. 微生物學雜志, 2009, 29(5)∶ 67-72.

[5]李艷霞, 吳松浩. 食品微生物檢測技術的研究進展[J]. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(7)∶ 270-273.

[6]張玉霞, 黃鳴. 食品檢驗中多重PCR技術的應用[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2008, 18(5)∶ 958-960.

[7]RAJLHOWA S, DAS R, BORA S, et al. Detection of shiga toxinproducing Escherichia coli and enteropathogenic Escherichia coli in faecal samples of health mithun (Bos frontalis) by multiplex polymerase chain reaction[J]. Zoonoses Public Health, 2009, 23(5)∶ 34-40.

[8]LEARY C D, LUCEY B. Comparison of the EntericBio multiplex PCR system with routine culture for detection of bacterial enteric pathogens [J]. Clin Microbiol, 2009, 47(11)∶ 3449-3453.

[9]凌霞, 張敬平, 肖勇, 等. 食源性致病菌多重PCR快速檢測方法建立與應用[J]. 微生物學雜志, 2010, 30(4)∶ 39-43.

[10]王耀, 曹際娟, 閆平平, 等. 食品中3種致病李氏菌MPCR-DHPLC檢測方法的建立[J]. 食品科學, 2010, 31(8)∶ 158-162.

[11]劉書亮, 劉冬香, 賈仁勇, 等. 多重PCR檢測食源金黃色葡萄球菌nuc、blaZ和mecA基因方法的建立與應用[J]. 中國人獸共患病學報, 2010, 26(5)∶ 475-480.

[12]徐偉, 劉軍, 李素芳. 單增李斯特菌與志賀氏菌多重PCR檢測技術的建立[J]. 中國食品學報, 2009, 9(1)∶ 201-207.

[13]田靜, 計融, 楊軍, 等. PCR方法快速檢測食品中的金黃色葡萄球菌[J]. 衛(wèi)生研究, 2007, 36(2)∶ 183-186.

[14]陳建輝, 楊勁松, 陳愛平, 等. 應用PCR技術快速檢測沙門菌[J]. 海峽預防醫(yī)學雜志, 2009, 15(3)∶ 55-57.

[15]唐雨德, 梁洪軍, 周東明, 等. 應用多重PCR檢測食品中的沙門菌[J]. 實用預防醫(yī)學, 2009, 16(5)∶ 1366-1369.

[16]汪學榮, 彭祥偉. PCR技術檢測肉中食源性病原菌的研究進展[J]. 肉類工業(yè), 2010(7)∶ 52-55.

[17]RK Y S, LEE S R, KIM Y G. Detection of Escherichia coli O157∶H7, Salmonella spp., Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in Kimchi by multiplex polymerase chain reaction (mPCR)[J]. Journal of Microbiolog February, 2006, 44(1)∶ 92-97.

[18]SETTANNI L, CORSETTI A. The use of multiplex PCR to detect and differentiate food- and beverage- associated microorganisms∶ a review[J]. Journal of Microbiological Methods, 2007, 69(11)∶ 12-22.

[19]GRAY K M, BANADA P P, O NEAL E, et al. Rapid Ped-2E9 cellbased cytotoxicity analysis and genotyping of Bacillus species[J]. Journal of clinical Microbiology, 2005, 43(12)∶ 5865-5872.

[20]黃銀花, 胡曉湘, 占利, 等. 影響多重PCR擴增效果的因素[J]. 遺傳, 2003, 25(1)∶ 65-68.

[21]ROY A, FAYAD A, BARTH G, et al. A multiplex polymerase chain reaction method for reliable, sensitive and simultaneous deteetion of multiple viruses in citrus trees[J]. Journal of Virological Methods, 2005, 129(1)∶ 47-55.

Establishment and Application of a Multiplex PCR Assay for Detection of Three Pathogenic Bacteria in Food

QIAN Zhi-wei1，SUN Xin-cheng2
(1. Department of Food Science, Henan Vocational College of Agriculture, Zhengzhou 451450, China；2. School of Food and Biological Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450002, China)

Objective∶ To develop a rapid multiplex polymerase chain reaction (m-PCR) assay for simultaneous detection of Salmonella spp., Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in food. Methods∶ The genomic alignment method was used to identify specific PCR target sequences. Three pairs of specific primers were designed with Primer Premier 5.0 according to the invasive protein gene (invA) of Salmonella, the nuc gene of Staphylococcus aureus and the prs gene of Listeria monocytogen. Multiplex PCR was established by optimizing the reaction system. Results∶ The sensitivity of the multiplex PCR method was 7.6 pg/μ L for Salmonellla spp., 3.8 pg/μ L for Staphylococcus aureus, and 5.1 pg/μL for Listeria monocytogenes. All specific primers were amplified, and their corresponding strips were observed in validation experiments without cross reactivity. Conclusions∶ A triple PCR assay has been established for the simultaneous, sample, rapid and sensitive detection of Salmonella spp., Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in food.

food-borne pathogenic bacteria；multiplex polymerase chain reaction (m-PCR)；Salmonella spp.；Staphylococcus aureus；Listeria monocytogen；food inspection

TS207.4

A

1002-6630(2011)16-0236-04

2010-11-17

河南省科技廳重點攻關項目(102102310093)

錢志偉(1969—)，男，副教授，碩士，研究方向為食品安全與質(zhì)量控制。E-mail：qzwhnac@126.com

*通信作者：孫新城(1977—)，男 ，講師，碩士，研究方向為病毒學及食品安全檢測。E-mail：biosxc@126.com