不同品種荔枝果實游離氨基酸分析

楊苞梅，姚麗賢，國 彬，何兆桓，李國良，周昌敏，涂仕華

(1.廣東省農業科學院土壤肥料研究所，廣東省養分資源循環利用與耕地保育重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.國際植物營養研究所成都辦事處，四川 成都 610066)

不同品種荔枝果實游離氨基酸分析

楊苞梅1，姚麗賢1，國 彬1，何兆桓1，李國良1，周昌敏1，涂仕華2

(1.廣東省農業科學院土壤肥料研究所，廣東省養分資源循環利用與耕地保育重點實驗室，廣東 廣州 510640；2.國際植物營養研究所成都辦事處，四川 成都 610066)

為探明荔枝果實中游離氨基酸組成及含量，采用AccQ·Tag柱前衍生反相高效液相色譜法測定紫娘喜、大丁香、黑葉、蘭竹和甜眼荔枝果實中的17種游離氨基酸含量。結果表明：測定方法重現性好，精密度高；甜眼果實中的人體必需氨基酸含量占氨基酸總量的36.4%，人體必需氨基酸含量與非必需氨基酸含量之比為0.57，較接近理想蛋白質的標準要求；紫娘喜、大丁香、黑葉、蘭竹和甜眼荔枝果實均含有豐富的藥效氨基酸、鮮味氨基酸、甜味氨基酸以及少量的芳香族氨基酸，但不同品種間的含量及比例差異較大。因此，不同荔枝品種的口感和風味明顯不同。

反相高效液相色譜法；6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基-氨基甲酸酯(AQC)；氨基酸；荔枝

荔枝(Litchi c hinensis S onn)，為無患子科(Sapindaceac)荔枝屬(Litchi)植物，原產于我國南部，被譽為中華之珍品[1]。氨基酸是果實品質的組成成分之一，并參與果實其他品質特征成分和風味物質的合成[2]。果實中氨基酸組分的準確定性定量分析，對正確評價水果品質具有重要意義。

氨基酸是組成蛋白質的基本單位，是生物體中不可缺少的營養成分之一。目前，氨基酸的分析測定方法較多，現階段應用最多的是氨基酸自動分析儀法，但隨著氨基酸分析技術的發展，柱前衍生反相高效液相色譜法因其通用性強、選擇性好、分離度高、可用于多種物質分析等優點而發展最快，因而廣泛應用于氨基酸的分析測定[3-4]。目前，采用柱前衍生反相高效液相色譜法測定荔枝花粉[5]的游離氨基酸及采用氨基酸自動分析儀測定荔枝核[6]的游離氨基酸已有報道，但關于荔枝果肉的氨基酸組成及其含量研究尚未見有報道。AccQ· Tag方法是美國Waters公司專為柱前衍生高效液相分析氨基酸而開發的創新方法，其核心在于名為AQC(6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基-氨基甲酸酯)的專利衍生劑能與所有含氨基的化合物發生快速、定量反應[7-9]。目前國內外對荔枝的植物學性狀、生物學特性、栽培技術、果實理化品質和抗氧化成分分析等方面的研究較多，但關于荔枝氨基酸組成及營養價值的研究尚未見詳細的報道。本實驗采用AccQ·Tag柱前衍生反相高效液相色譜法分析測定我國荔枝主栽品種果實的游離氨基酸組成及含量，旨在為荔枝的品質及功效成分研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試荔枝為國內荔枝主產區的主栽品種，分別為廣東省高州市的黑葉(21.77715°N，111.00111°E)和增城市的甜眼(23.24423°N，113.76718°E)，福建省漳州市的蘭竹(24.47054°N，117.62058°E)，海南省海口市的紫娘喜(19.92593°N，110.28575°E)和大丁香(19.90411°N，110.26947°E)。在荔枝成熟期收獲整株果實，充分混勻后采集果實樣本各3個，帶回實驗室即時分析荔枝果肉的17種游離氨基酸含量。

天冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、精氨酸(Arg)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、賴氨酸(Lys)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)和苯丙氨酸(Phe)標準品和混合品、AQC柱前衍生劑、乙酸鈉-三乙胺緩沖液 美國Waters公司；乙腈為色譜純；實驗用水為MilliQ高純水。

2695高效液相色譜儀(配2475熒光檢測器和色譜工作站) 美國Waters公司；RE-52AA真空旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；Lab dancer渦旋混合器 德國IKA公司；KQ5200DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UFE600烘箱 德國MEmmERT公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Mobile phase composition for HPLC gradient elution

色譜柱為Waters AccQ·Tag氨基酸分析柱(3.9mm× 150mm，4μm)；流速：1.0mL/min；柱溫37℃；熒光檢測激發波長250nm、發射波長395nm。流動相A為乙酸鈉-三乙胺緩沖液[使用時以1∶10(V/V)用高純水稀釋，超聲波脫氣1min]；流動相B為乙腈；流動相C為高純水。梯度洗脫程序見表1。

1.2.2 樣品處理及柱前衍生

取荔枝果肉搗碎成漿，漿汁于6000r/min離心15min，取上清液0.45μm膜過濾，濾液于4℃冰箱保存，備用。并同步做果肉密度實驗。

移取10μL已稀釋的樣品注入6mm×50mm衍生管底部，加入170μL硼酸鹽緩沖液，渦旋混合。另移取20μL剛配好的AccQ·Fluor衍生劑，在渦旋狀態下加入衍生管中，并保持渦旋混合10s。室溫放置1min，用石蠟膜封口，放在55℃恒溫烘箱內加熱10min，取出冷卻至室溫，直接進樣20μL分析。

1.2.3 氨基酸的定性及定量測定

根據氨基酸標準品的保留時間和熒光光譜對樣品中的氨基酸定性，用Waters色譜工作站測定純度后，依據外標曲線計算氨基酸的含量/(μg/g)。

1.2.4 氨基酸組成的分析方法

1.2.4.1 計算人體、兒童必需氨基酸含量占氨基酸總量的質量分數

氨基酸總量用T表示，人體必需氨基酸含量(Ile、Leu、Lys、Thr、Val、Phe、Met含量之和)用E表示，非必需氨基酸含量(Cys、His、Arg、Ala、Asp、Glu、Gly、Pro、Ser、Tyr含量之和)用N表示，兒童必需氨基酸含量(His和Arg含量之和)用CE表示。計算人體必需氨基酸含量占氨基酸總量的百分比(E/T)、兒童必需氨基酸含量占氨基酸總量的質量分數(CE/T)及人體必需氨基酸含量與非必需氨基酸含量之比(E/N)。

1.2.4.2 計算各種人體必需氨基酸占氨基酸總量的相對含量

分別計算Thr、Val、Met＋Cys、Ile、Leu、Phe＋Tyr和Lys占氨基酸總量的質量分數，并與1973年FAO/ WHO修訂的人體必需氨基酸含量模式譜(以下簡稱氨基酸模式譜)比較[10]。

1.2.4.3 計算各類味覺氨基酸含量

鮮味氨基酸含量為Glu和Asp之和，甜味氨基酸含量為Ala、Gly、Ser和Pro含量之和，芳香族氨基酸為Tyr和Phe含量之和。并計算鮮味氨基酸、甜味氨基酸和芳香族氨基酸占氨基酸總量的質量分數。

試驗數據用SAS 9.0國際通用統計軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 方法的回歸方程、相關系數及檢出限

配制濃度分別為2、5、10、15、25、50μmol/L的氨基酸混標溶液，每一標準液依上法衍生后取20μL進行測定，以氨基酸溶液濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制氨基酸的標準工作曲線，并利用峰面積與濃度進行線性回歸，以信噪比為10計算檢出限，結果如表2所示。

表2 線性回歸方程、相關系數、相對標準偏差及檢出限Table 2 Linear regression equations, correlation coefficients, RSD and detection limits of 17 amino acids derivatives

表4 荔枝中所含人體必需氨基酸的比例與氨基酸模式譜的比較Table 4 Essential amino acid composition of litchi fruits from 5 different cultivars %

2.2 氨基酸標準溶液的色譜分離

按上述色譜條件進行操作，17種氨基酸混合標準液AQC衍生物的色譜分離見圖1，所有衍生物均可獲得較好的分離。

圖1 標準氨基酸衍生物的色譜分離譜圖Fig.1 Chromatograms of 17 amino acid standard derivatives

2.3 荔枝果實氨基酸含量及組成

2.3.1 必需氨基酸含量及組成

由表3、4可知，不同品種荔枝果實氨基酸總量、人體必需氨基酸總量、人體非必需氨基酸總量及兒童氨基酸總量均存在顯著性差異。蘭竹果實中氨基酸總量最高，而人體必需氨基酸總量及比例最低；黑葉果實中氨基酸總量最低；甜眼果實中人體必需氨基酸總量最高；紫娘喜果實中兒童必需氨基酸含量及比例均最高，其次是蘭竹，黑葉含量最低，甜眼比例最低。1973年FAO/ WHO提出的的理想蛋白質的標準是E/T為40%左右[10]，E/N在0.60以上[10]。可見，甜眼果實中的蛋白質較接近理想蛋白質的要求，而其他4種荔枝果實中的蛋白質均遠未達到理想蛋白質的要求。與氨基酸模式譜比較，黑葉僅有VaL和Met＋Cys兩項、甜眼僅Thr一項及紫娘喜僅有Val一項指標符合氨基酸模式譜，而蘭竹和大丁香則無任何指標符合氨基酸模式譜。

表5 荔枝中所含藥效氨基酸含量Table 5 Medicinal amino acids and their relative contents in litchi fruits from 5 different cultivarsμg/g

表6 荔枝中所含味覺氨基酸含量Table 6 Tasty amino acids, aromatic amino acids and their relative contents in litchi fruits from 5 different cultivarsμg/g

2.3.2 藥效氨基酸含量及組成

表5表明，黑葉、蘭竹、甜眼、紫娘喜和大丁香果實中含有豐富的藥效氨基酸。5種荔枝品種中，紫娘喜果實中的8種藥效氨基酸總量最高，其次是黑葉，再次是甜眼，而蘭竹最低。8種藥效氨基酸總和占氨基酸總量的比例大小依次為黑葉＞紫娘喜＞甜眼＞大丁香＞蘭竹。黑葉中含量最高的是Glu，其次是Asp、Arg、Tyr、Lys、Gly和Phe，Leu含量最低；蘭竹中含量最高的是Glu，其次是Arg、Asp、Lys、Tyr、Leu和Gly，Phe含量最低；甜眼中含量最高的是Glu，其次是Asp、Arg、Lys、Phe、Tyr和Gly，Leu含量最低；紫娘喜中含量最高的是Asp，其次是Arg、Glu、Leu、Phe、Gly和Tyr，Lys最低；大丁香中含量最高的是Asp，其次是Glu、Arg 、Gly、Leu、Phe和Tyr，Lys含量最低。可見，5種荔枝果實中含量較高的藥效氨基酸是Glu、Asp和Arg，含量較低是Lye和Leu。

2.3.3 味覺氨基酸含量

由表6可知，荔枝果實含有豐富的鮮味氨基酸和甜味氨基酸以及少量的芳香族氨基酸，但不同品種間的含量及比例差異較大。5種荔枝品種中，甜眼果實中的鮮味氨基酸含量之和最高，黑葉位居第1，其次是紫娘喜，再次是大丁香，而蘭竹最低。鮮味氨基酸含量之和占氨基酸總量的比例大小依次為黑葉＞甜眼＞紫娘喜＞大丁香＞蘭竹。蘭竹果實中的甜味氨基酸含量之和及占氨基酸總量的比例均最高，大丁香位居第二，其次是紫娘喜，再次是甜眼，黑葉最低。黑葉果實中的芳香族氨基酸含量之和及占氨基酸總量的比例均位居第一，紫娘喜位居第二，而甜眼均最低。因此，不同荔枝品種的口感風味明顯不同。

3 結 論

甜眼荔枝果實中的人體必需氨基酸含量占氨基酸總量的質量分數為36.4%，人體必需氨基酸含量與非必需氨基酸含量之比為0.57，較接近理想蛋白質的要求。紫娘喜、大丁香、黑葉、蘭竹和甜眼5種荔枝果實含有豐富的鮮味氨基酸和甜味氨基酸以及少量的芳香族氨基酸，但不同品種間的含量及比例差異較大。5種荔枝中，甜眼果實中的鮮味氨基酸含量之和最高，黑葉果實中的鮮味氨基酸含量之和占氨基酸總量的比例最高，蘭竹果實中的甜味氨基酸含量之和及占氨基酸總量的比例均最高。因此，不同荔枝品種的口感風味明顯不同。

[1]農業部發展南亞熱帶作物辦公室. 中國熱帶南亞熱帶果樹[M]. 北京∶中國農業出版社, 1998∶ 69-90.

[2]KEUTGEN A J, PAWELZIK E. Contribution of amino acids to strawberry fruit quality and their relevance as stress indicators under NaCl salinity[J]. Food Chemistry, 2008, 111(3)∶ 642-647.

[3]侯松嵋, 孫敬, 何紅波, 等. AQC柱前衍生反相高效液相色譜法測定土壤中氨基酸[J]. 分析化學, 2006, 34(10)∶ 1395-1400.

[4]吳光斌, 陳發河. 柱前衍生高效液相色譜法測定食品中的氨基酸含量[J]. 仲愷農業技術學院學報, 2006, 19(3)∶ 26-30.

[5]陳獻雄, 楊劍. HPLC法測定荔枝花粉中氨基酸含量[J]. 安徽農業科學, 2008, 36(25)∶ 10750-10751; 10778.

[6]黃雪松, 陳杰. 測定荔枝核中游離氨基酸[J]. 氨基酸與生物資源, 2007, 29(2)∶ 11-14.

[7]盧珍華, 郭彩華. AccQ·Tag法測定綠豆蛋白酶解液中的氨基酸含量[J]. 食品科學, 2006, 27(2)∶ 238-241.

[8]陳永波, 饒斌, 覃蘭. Accq·Tag法應用技巧[J]. 氨基酸和生物資源, 2001, 23(4)∶ 47-49.

[9]龐新安, 萬英, 王亞萍. AccQ·Tag柱前衍生反相高效液相色譜法測定果品中氨基酸含量[J]. 安徽農學通報, 2007, 13(16)∶ 32-34.

[10]天津工業學院, 無錫輕工業學院. 食品生物化學[M]. 北京∶ 中國輕工業出版社, 2002.

Analysis of Free Amino Acids in Litchi Fruits from Different Cultivars

YANG Bao-mei1，YAO Li-xian1，GUO Bin1，HE Zhao-huan1，LI Guo-liang1，ZHOU Chang-min1，TU Shi-hua2
(1. Guangdong Key Laboratory of Nutrient Cycling and Farmland Conservation, Soil and Fertilizer Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China；2. Chengdu Office of International Plant Nutrition Institute, Chengdu 610066, China)

An AccQ·tag precolumn derivatization and reversed phase HPLC method was presented to determine the contents of 17 free amino acids in litchi fruits from 5 different cultivars, Ziniangxi, Dadingxiang, Heiye, Lanzhu and Tianyan. The method proved highly reproducible and precise. The ratio of essential amino acids to total amino acids was 36.4% and to non-essential amino acids 0.57 in Tianyan, indicating good agreement with the ideal human protein requirements. The five litchi cultivars were all rich in medicinal, umami and sweet amino acids with a difference in their contents and small amounts of several aromatic amino acids were also found. Therefore, different litchi cultivars distinctly differ in taste and flavor.

reversed phase high performance liquid chromatography；AQC；amino acids；litchi

S667.1

A

1002-6630(2011)16-0249-04

2010-11-09

國家現代農業產業技術體系建設專項(nycytx-32)；國際植物營養研究所資助項目

楊苞梅(1983—)，女，助理研究員，碩士，主要從事植物營養與生理研究。E-mail：yangbaomei163@163.com