高效液相色譜法測定芍藥中齊墩果酸和熊果酸含量

周春華，呂三三，張 瑩，胡 玥，陶 俊*

(揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇 揚州 225009)

高效液相色譜法測定芍藥中齊墩果酸和熊果酸含量

周春華，呂三三，張 瑩，胡 玥，陶 俊*

(揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇 揚州 225009)

目的：建立高效液相色譜法測定芍藥不同器官中齊墩果酸和熊果酸含量的檢測方法。方法：超聲波乙醇提取樣品中的齊墩果酸和熊果酸，色譜柱為Lichrospher C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15，V/V)，柱溫30℃，流速1mL/min，檢測波長210nm。結(jié)果：齊墩果酸和熊果酸在25～100μg/mL范圍內(nèi)均呈良好的線性關系，相關系數(shù)均在0.998(n＝5)以上；日內(nèi)差異系數(shù)和日間差異系數(shù)分別為1.27%～2.96%和1.33%～3.64%，OA和UA精確性分別為1.28%～3.52%和0.96%～2.88%，平均回收率分別為98.87%和98.70%。結(jié)論：該方法簡單快速、結(jié)果準確，可為測定芍藥不同組織中齊墩果酸和熊果酸含量提供一種高效快速的測定方法。

高效液相色譜法；芍藥；齊墩果酸；熊果酸

芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)是毛茛科芍藥亞科芍藥屬多年生宿根草本植物，主要分布在我國山東、浙江、安徽、河南、四川、云南、陜西和甘肅等地。芍藥根具有較高的藥用價值，是一種重要的中藥材，其生物活性物質(zhì)主要有單萜類化合物、三萜類化合物、揮發(fā)油、單寧、鞣質(zhì)、黃酮類及酚類等，其中單萜類化合物中的芍藥苷是芍藥中最主要的生物活性物質(zhì)[1-4]。而在藥用芍藥栽培中，地上部分常常被作為廢棄物丟棄，造成了資源的巨大浪費。

齊墩果酸(oleanolic ac id，OA)和熊果酸(ursolic acid，UA)是近年來倍受人們關注的三萜類化合物，兩者互為同分異構(gòu)體，通常以游離或結(jié)合成苷的形式廣泛存在于植物界。研究表明，它們主要存在于女貞子[5]、山茱萸[6]、白花蛇舌草[7]、柿[8]、枇杷[9]、棗[10]、山楂[11]和木瓜[12]等植物中。醫(yī)學研究表明，OA和UA均具有抗腫瘤[13]、抗病毒[14]、抗炎[15]、抗菌[16]、護肝[17]、降血糖[18]等多種生物活性。以往關于芍藥的藥用研究主要集中在根上，其化學成分主要以單萜化合物為主，迄今為止，尚未見有關芍藥三萜化合物OA和UA的研究報告。預試驗研究顯示，芍藥葉片、花朵、莖干中均含有OA和UA等三萜類化合物，其中葉片含量最高。

植物中OA和UA的含量分析方法主要包括薄層掃描法(thin layer chromatography scanning，TLCS)、毛細管電泳法(capillary electrophoresis，CE)、氣相色譜法(gas chromatography，GC)和高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)。其中HPLC是最常見的分析方法，使用此方法在女貞子[5]、山茱萸[6]、白花蛇舌草[7]、柿[8]、枇杷[9]、棗[10]、山楂[11]和木瓜[12]等多種植物中均同時檢測到了OA和UA。

本實驗以OA和UA的含量作為考察指標，利用超聲提取，建立簡便、快速、準確測定芍藥不同組織中OA和UA含量的高效液相色譜檢測方法，為芍藥資源的綜合利用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)采自揚州大學園藝與植物保護學院芍藥種質(zhì)資源圃內(nèi)。選取“楊妃出浴”、“粉珠盤”和“紅峰”3個品種，于2009年5月1日采集上述3個品種葉片、花朵和莖干樣品。所有采集的樣品帶回實驗室后立即用液氮冷凍處理，然后存放在-20℃冰箱中，直至分析。

OA、UA標準品 南京替斯艾么(TCM)中藥研究所；甲醇(HPLC級) 美國Tedia試劑公司；去離子水由Millipore超純水系統(tǒng)制備；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

2695高效液相色譜儀[配備2487紫外檢測器和Lichrospher C18柱(250mm×4.6mm，5μm)] 美國Waters公司；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；KQ-500B超聲波清洗器 江蘇昆山超聲儀器有限公司；TDL-40B離心機 上海金鵬分析儀器有限公司；分析天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司；微孔濾膜(0.22μm)。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

OA和UA的定量在高效液相色譜儀系統(tǒng)中進行。兩種物質(zhì)均在210nm波長處檢測，流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15，V/V)。流速為1mL/min，柱溫為30℃。

1.3.2 標準品溶液的制備及標準曲線繪制

OA和UA標準樣品分別用甲醇配成2mg/mL貯備液。分別量取OA和UA標準樣品溶液0.025mL置于同一個離心管中，加入甲醇1.975mL，搖勻，制成OA和UA質(zhì)量濃度分別為25μg/mL的混合標準溶液，按上述方法配制OA和UA質(zhì)量濃度分別為50、75、100μg/ mL的混合標準溶液。在進行HPLC測定時，上述不同質(zhì)量濃度的混合標準溶液分別進樣10μL測定峰面積，用于繪制標準曲線。

1.3.3 分析方法驗證

按1.3.2節(jié)方法制備標準溶液，對4個質(zhì)量濃度的OA和UA標樣進行HPLC測定，精密吸取每一標樣溶液10μL，按上述色譜條件連續(xù)3次進樣，根據(jù)標樣質(zhì)量濃度和峰面積繪制標準曲線，進行峰面積與質(zhì)量濃度的線性回歸分析。

為了測定每個標樣的日內(nèi)差，每個質(zhì)量濃度在同1d內(nèi)注射5針。然后連續(xù)3d進行測定以確定日間的精確度(即日間差)。

為了計算提取回收率，在提取前于研磨好的3g植物材料(“楊妃出浴”葉片)中加入30μg OA和300μg UA。此后的提取和HPLC分析均按照上述方法進行操作，并計算回收率。

式中：A是加入標樣后檢測到的含量；B是沒有加標樣時檢測到的含量；C是加入標樣的量。

1.3.4 待測液的制備

用天平稱取3.0g鮮樣，置于研缽中，加液氮研至粉末狀，放入10mL離心管中，加入5mL乙醇，在超聲波清洗器中提取30min，15℃、8000×g離心10min。每樣品總共提取2次，合并兩次濾液，35℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥。殘留物溶于1.5mL甲醇中，并轉(zhuǎn)移至2mL離心管中。在HPLC上樣前用0.22μm微孔濾膜過濾。每個樣品重復3次。

1.3.5 樣品測定

將處理后的樣品溶液進行液相色譜分析，進樣量10μL，采用外標法定量，測定3個品種芍藥葉片、花朵和莖干中OA和UA的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC鑒定OA和UA

OA和UA標樣在210nm波長處均能檢測到，且在210nm左右有最大吸收峰。在甲醇(A)和0.1%磷酸溶液(B)配比為85∶15(V/V)時，OA和UA能有效地洗脫，而且能被同時檢測。在流速為1mL/min時，OA和UA的保留時間分別為26.086、27.229min(圖1a)。這種HPLC體系能成功分離芍藥葉片中的OA和UA(圖1b)。

2.2 檢測方法確認

2.2.1 線性關系

兩種標準品配制4種不同質(zhì)量濃度(25、50、75、100μg/mL)的溶液，分別重復5次測試。校準曲線均呈線性關系，峰面積(Y)與標準品質(zhì)量濃度(X)的回歸方程為：YOA＝1217.2X(r＝0.998)，YUA＝1499.6X(r＝0.998)，表明OA和UA在25～100μg/mL范圍內(nèi)均呈良好線性關系，可用于定量分析。

2.2.2 重復性和精確度

表1 OA和UA重復性和精確性分析(n=5)Table 1 Repeatability and accuracy of OA and UA analysis (n=5)

3種標樣的重復性和精確度采用上述方法，通過4種不同的質(zhì)量濃度來分析測定(表1)。OA和UA的日內(nèi)差異系數(shù)分別為1.46%～2.84%和1.27%～2.96%，日間差異系數(shù)分別為1.33%～3.32%和1.97%～3.64%。方法的精確性用測定值與所有質(zhì)量濃度理論值的偏差來表示，OA和UA的精確性分別為1.28%～3.52%和0.96%～2.88%。

2.2.3 回收率實驗分析

為了計算提取回收率，在提取前于研磨好的3g植物材料中加入30μg OA和300μg UA。然后按上述方法進行提取、檢測和分析。通過計算分析值和加入量的比例分別來計算3種成分的回收率。結(jié)果表明，OA和UA的回收率分別為98.87%和98.70%(表2)。

2.3 芍藥不同器官OA和UA含量分析

由表3可知，芍藥不同器官中OA和UA含量差別很大，以 楊妃出浴 、 粉珠盤 和 紅峰 3個品種為例，3個品種不同組織中均檢測到OA和UA，且UA含量均高于OA。對于葉片和花朵來說，3個品種中OA和U A的含量均以“楊妃出浴”最高，“粉珠盤”最低，“紅峰”介于其中。而對于莖干來說，3個品種中OA和UA的含量則以“粉珠盤”最高，“紅峰”最低，“楊妃出浴”介于其中。從3種不同器官OA和UA的總量來看，葉片明顯高于花和莖干，其中“楊妃出浴”葉片中OA和UA總量最高，為119.56μg/g，“粉珠盤”最低，為54.54μg/g。

表3 芍藥不同器官OA和UA的含量Table 3 OA and UA contents in different organs of peonyμg/g

3 討論與結(jié)論

3.1 芍藥中OA和UA分析體系的建立

常用的流動相系統(tǒng)有甲醇-水和乙腈-水兩種。甲醇和乙腈的體積分數(shù)一般在85%～90%[19]。在流動相加入少量冰醋酸(0.08%～0.1%)、磷酸(0.1%)、三乙胺(0.06%～0.1%)有利于改善峰形，提高分離度[20]。本實驗曾對甲醇-磷酸緩沖液(88∶12，V/V)、甲醇-水(85∶15，V/V)和甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15，V/V)這3種不同流動相做過對比篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用甲醇-磷酸緩沖液做流動相時，由于鹽的存在，色譜柱容易堵塞。采用甲醇-水做流動相，OA和UA的分離度小于1，且峰形不好，在水中加入0.1%磷酸，其分離度較高，峰形也得到較好的改善。對流動相的流速進行選擇發(fā)現(xiàn)，流速對出峰時間影響較大，在流速0.6mL/min時，出峰時間大約在50min左右，而當流速升到1mL/min時，出峰時間縮短到30min左右。許多文獻[7-9,11-12]中OA和UA的保留時間在18～29min之間，本實驗OA和UA的保留時間分別為26.086、27.229min，和文獻結(jié)果基本一致。在本實驗建立的色譜條件下，芍藥不同器官中OA和UA的分離良好，方法簡便快速，結(jié)果準確可靠。同時用該方法對柿子果肉和果皮中OA和UA含量進行了測定，發(fā)現(xiàn)其峰形和分離度也較好，說明該方法有一定的普適性。

3.2 芍藥不同組織器官中OA和UA的含量

研究表明，OA和UA在同種植物的不同組織器官中的含量存在著很大差異。王麗萍等[21]研究發(fā)現(xiàn)，川鄂山茱萸總苞片的UA含量(1.1044%)最高、果實(0.0899%)最低，莖干、葉片和花介于中間，同一器官的不同組織部位中的OA和UA的含量也有差別。劉名權(quán)等[22]研究顯示，毛泡桐葉片中的OA含量(0.222%)約為葉柄(0.025%)的9倍，葉片中UA的含量(0.61%)約為葉柄(0.21%)的3倍。周春華[23]研究表明枇杷花萼片的OA和UA含量最高，分別為0.68、3.65mg/g，花瓣中OA和UA的含量最低，分別為0.12mg/g和0.60mg/g，雌雄蕊和穗梗中OA和UA的含量介于萼片和花瓣之間。

本研究顯示，芍藥不同器官OA和UA含量差別很大，3個芍藥品種“楊妃出浴”、“粉珠盤”和“紅峰”的OA和UA含量均以葉片最高。OA在葉片中的含量分別是莖干的72.7、1.3、11.4倍，花的2.7、23.5、21.2倍；UA在葉片中的含量分別是莖干的30.2、39.7、35.6倍，花的65.0、5.8、190.4倍。

3.3 本研究建立了高效液相色譜測定芍藥不同器官中OA和UA含量的方法，該測定方法操作簡便易行，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可以快速準確地對芍藥不同器官中OA和UA進行定量分析，可為芍藥資源的綜合開發(fā)利用研究提供參考。

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Analysis of Oleanolic and Ursolic Acids in Peony (Paeonia lactiflora Pall. ) by HPLC

Objective∶ To establish a HPLC method to determine the contents of oleanolic acid (OA) and ursolic acid (UA) in different organs of Paeonia lactiflora Pall.. Method∶ Oleanolic and ursolic acids were extracted from samples with ethanol under the assistance of ultrasonic. The chromatographic separation was conducted on a Lichrospher C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5μm) using a mobile phase made up of methanol and 0.1% phosphoric acid solution (85∶15, V/V) at a flow rate of 1 mL/min. The column temperature and the detection wavelength were set as 30 ℃ and 210 nm, respectively. Results∶ The linearity of OA and UA was in the range of 25-100μg/mL with a correlation coefficient over 0.998 (n = 5). The overall intra-day and inter-day variation coefficients were 1.46%-2.84% and 1.33%-3.32% for OA and 1.27%-2.96% and 1.97%-3.64% for UA, respectively. The accuracy of determination of OA and UA was 1.28%-3.52% and 0.96%-2.88%, respectively. Conclusion∶The method is convenient, rapid and accurate, and can thus be used to separate and quantify OA and UA in different organs of Paeonia lactiflora Pall..

high performance liquid chromatography (HPLC)；Paeonia lactiflora Pall.；oleanolic acid；ursolic acid

TS255.1

A

1002-6630(2011)16-0265-04

2010-11-03

2009年揚州大學大學生學術科技創(chuàng)新基金項目；“十一五”江蘇省科技支撐計劃(農(nóng)業(yè))項目(BE2009318)；江蘇省科技基礎設施建設計劃(科技公共服務平臺)項目(BM2010590)

周春華(1974—)，男，副教授，博士，研究方向為園藝植物生物活性物質(zhì)。E-mail：chzhou@yzu.edu.cn

*通信作者：陶俊(1966—)，男，教授，博士，研究方向為觀賞植物栽培與遺傳生理。E-mail：taojun@yzu.edu.cn