多維數據分析法同時分辨3種熒光光譜重疊的氨基酸

薛永林，任守信，張雁冰，高 玲*

(內蒙古大學化學化工學院，內蒙古 呼和浩特 010021)

多維數據分析法同時分辨3種熒光光譜重疊的氨基酸

薛永林，任守信，張雁冰，高 玲*

(內蒙古大學化學化工學院，內蒙古 呼和浩特 010021)

研究正交信號校正(orthogonal signal correction，OSC)-小波包變換(wavelet packet transform，WPT)-偏最小二乘法(partial least squares，PLS)法用于不經化學分離直接解析熒光光譜嚴重重疊的色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸混合體系。本實驗POSCWPTPLS程序執行相關計算，并將3種化學計量學方法(OSC-WPT-PLS、WPT-PLS和PLS)進行比較。3種氨基酸的總體相對預測標準偏差分別為2.80%、4.35%和5.14%，結果表明：OSC-WPT-PLS法優于WPT-PLS法和PLS法，將該法用于測定自來水及內蒙產的金駱駝酒和河套老窖酒中的色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸的含量及其回收率分別為96.9%～103.2%、94.1%～105.4%、95.3%～107.8%，取得良好效果。

多維數據分析；熒光光度法；同時測定；色氨酸；酪氨酸；苯丙氨酸

化學計量學是化學、數學、統計學與計算機科學的接口，在試驗設計、數據處理、信號解析、化學分類決策及預報方面有著重要的作用。在食品科學中引入化學計量學可以較好消除背景干擾，分辨食品檢測重疊波譜，揭示波譜數據中隱含的信息如結構、種類、性狀等[1-7]。

氨基酸是蛋白質的基本結構單位，是動物體合成蛋白質的原料來源，也是人體中必不可少的營養成分之一，屬食品、飼料的營養成分，在醫學上具有防病治病的作用，也可作為營養型化妝品的有效成分及合成藥物、表面活性劑、其他工業產品的化工原料。因此，對氨基酸的分析檢測具有重要意義。熒光分析法具有快速、簡便、靈敏度高等特點，在痕量分析中應用廣泛[8]。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸[9-10]是僅有3種具有內源熒光的天然氨基酸，但是3者的熒光激發、發射光譜均嚴重重疊，在熒光檢測中易互相干擾，這就為其多組分的同時測定造成了困難。同一樣品中多種共存組分的同時測定是實際生產、生活中常常面臨的問題，也是分析化學要解決的熱點問題[11]，因此，化學計量學的優點脫穎而出，它有利于提高信噪比，增加測量精密度，改善分析選擇性，拓寬應用范圍。本實驗將OSC、WPT和PLS方法相結合建立OSC-WPT-PLS化學計量學方法，對熒光光譜嚴重重疊的色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸混合物進行同時測定。

1 材料與方法

1.1 材料﹑試劑與儀器

金駱駝酒 內蒙古察右前期金駱駝酒業股份有限公司；河套酒 內蒙古巴盟河套酒業集團；L-色氨酸 北京市東環聯合化工廠；L-酪氨酸 國藥集團化學試劑有限公司；L-苯丙氨酸 天津市光復精細化工研究所。

3種氨基酸用二次蒸餾水分別配成1.27×10-3、1.89 ×10-2、1.40×10-2mol/L儲備液，工作液根據所需適當稀釋制備；緩沖液：NaH2PO4-NaOH，pH7.2；所用其他試劑除注明外均為分析純；所用水為二次蒸餾水。

RF-5301PC 日本Shimadzu儀器公司；pHS-3B型精密pH計 上海雷磁儀器廠；奔騰IV型計算機 中國聯想公司。

1.2 方法

1.2.1 OSC-WPT-PLS法原理

該方法把能有效消除熒光光譜矩陣中與濃度無關的結構噪音的正交信號校正法(orthogonal signal correction，OSC)[12]和能夠靈活實現域值轉換從而消除測量信號噪音的小波包變換法(wavelet packet transform，WPT)[13-16]與能有效提高回歸性能的經典偏最小二乘法(partial l east squares，PLS)[17]有機結合，建立OSC-WPT-PLS方法[18]。

該法是結合OSC、WPT和PLS3種方法優點構成的一種推廣的PLS方法。將由實驗數據構筑的訓練集矩陣D和預測集矩陣Du經平均中心化后，用OSC方法進行數據前處理，濾除結構噪音。為確保最佳的校正能力，最佳OSC因子數需經實驗選擇。OSC校正后的數據矩陣，經快速小波包變換轉入小波包域，通過最佳小波包基和除噪閾值的選擇濾除噪音，選擇處理后的小波包系數經小波包逆變化轉入原域。為確保小波包前處理能力，最佳小波包函數和分解水平需經實驗優化獲得。原始數據經OSC和WPT處理后進行PLS回歸。本法可同時解決信號校正、數據壓縮、消除噪音和共線及回歸等問題。根據上述原理，編制名為POSCWPTPLS程序，執行相關計算。

1.2.2 正交試驗設計

以L16(45)正交表進行正交試驗設計。加入16份不同濃度的3種氨基酸標準液于25.00mL容量瓶中，再加入3.00mL NaH2PO4-NaOH緩沖液(pH7.2)，然后用二次蒸餾水稀釋至刻度搖勻。用1cm石英比色皿，激發波長265nm，在260.0～400.0nm波長范圍，以0.2nm波長間隔，狹縫10nm，靈敏度為低的條件下測量其發射光譜的熒光強度。并以此數據構筑訓練集熒光強度矩陣D。以L9(33)正交表進行正交設計，將9個合成試樣溶液按上述方法建立預測集矩陣Du。

2 結果與分析

2.1 熒光光譜

3種化合物的激發、發射熒光光譜分別如圖1a、b所示。從圖1可以看出3種化合物的激發、發射光譜存在較嚴重的重疊，這使得用傳統的峰值定量進行選擇性分析非常困難。

圖1 3種氨基酸的激發光譜和發射光譜圖Fig.1 Excitation and emission spectra of phenylalanine, tryptophan and tyrosine

2.2 混合物體系熒光波長的選擇

激發、發射波長的選擇是多組分混合物熒光分析的一個重要因素。理想的波長范圍，是能夠盡可能大的保證不同組分的靈敏度，同時又要避免光譜干擾，比如瑞利散射的干擾等。從圖1可見，其3個組分熒光激發、發射光譜最大熒光強度分別在257/284nm(苯丙氨酸)、275/354nm(色氨酸)、274/304nm(酪氨酸)，3者的最大激發波長差別較小，而且3種物質的斯托克斯位移都不大，所以選擇激發波長和發射波長范圍在這個體系中顯得尤為重要。分別在250～290nm之間試驗不同的激發波長，對本體系熒光強度的影響，結果顯示當激發波長為265nm時，進行發射光譜掃描效果最好。

2.3 不同pH值對熒光強度的影響

酸度是影響熒光強度的重要因素，在pH6.5～10.5范圍內進行多次試驗，如圖3所示，pH值的變化對色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸的熒光強度均影響較大。在pH6.5～7.5時，3種氨基酸均具有較強的熒光信號。綜合考慮，最終選取3.0mL、pH7.2 NaH2PO4-NaOH緩沖液來控制體系的酸度。

圖2 溶液酸度對熒光強度的影響Fig.2 Effect of solution acidity on fluorescence intensities of tyrosine, tryptophan and phenylalanine

2.4 OSC-WPT-PLS方法

參數選擇是本法的關鍵步驟。本實驗選擇小波函數、小波分解水平(L)、OSC因子數和PLS因子數，分別對這4種參數進行優化試驗，結果見表1、2。以實驗數據矩陣D和Du作為原始數據，并比較所有組分的預測標準偏差(standard error of prediction，SEP)和相對預測標準偏差(relative standard error of prediction，RSEP)。不同的小波函數具有不同的除噪效果，為獲取最佳的除噪效果，進行Daubechies 由2～24，Symmlet由4～10和Coiflet由1～5的優化試驗，當選小波函數Daubechies為4時，所有組分的RSEP最小。小波分解水平L為1～7實驗結果顯示，當L=2時所有組分的RSEP最小。同時對OSC因子數進行試驗，結果顯示OSC因子數選為3時RSEP最小。最終實驗選定的最佳參數為小波函數Daubechies =4，L=2，OSC因子數=3和PLS因子數=3。

表1 小波包分解水平和其他參數的最佳化Table 1 Optimization of wavelet packet decomposition levels and other parameters

表2 小波函數的最佳化Table 2 Optimization of wavelet functions

表3 訓練集的組成Table 3 Composition of training set

按正交表L16(45)正交設計，配制16個色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸的混合溶液樣品，其濃度組成見表3。在260.0～400.0nm范圍每隔0.2nm測定其熒光強度，以此數據構筑訓練集熒光強度矩陣D，9個合成未知樣以同樣方式測量熒光強度，構筑訓練集熒光強度矩陣Du。經OSC-WPT-PLS方法計算合成樣中色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸的濃度和回收率，結果見表4。所有化合物的SEP和 RSEP分別為0.214mol/L和2.80%，表明本法成功。

表4 合成未知樣的實際濃度﹑測定濃度及回收率Table 4 Actual concentrations, determined concentrations and recovery rates of tyrosine, tryptophan and phenylalanine in synthetic unknown samples

2.5 OSC-WPT-PLS、WPT-PLS 和 PLS方法的比較

選用一組合成未知樣分別用OSC-WPT-PLS、WPTPLS和PLS 3種方法進行實驗。3種方法的比較結果見表5，由表5可見，所有化合物的總體RSEP分別為2.80%、4.35%和5.14%。結果表明3種方法均成功，且OSC-WPTPLS法的總體相對預測標準偏差最小，所以此法優于其他兩種方法。

表5 3種方法測定色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸體系的總體預測標準偏差和總體相對預測標準偏差Table 5 SEP and RSEP of tryptophan, tyrosine and phenylalanine determined by three methods

2.6 線性范圍及檢出限

對3種組分分別測定其線性范圍，結果表明，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸分別在0～1.78×10-5、0～3.78×10-5、0～2.52×10-3mol/L范圍內，與熒光信號呈良好的線性關系。對空白溶液進行11次平行測定，以空白溶液熒光強度的3倍標準偏差所對應的濃度計算方法的檢出限。表6分別為3種氨基酸的線性關系以及檢出限測定結果。

表6 線性方程及檢出限Table 6 Linear equations and detection limits of tyrosine, tryptophan and phenylalanine

2.7 精密度

配制色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸濃度分別為5.08× 10-6、7.56×10-6、5.60×10-4mol/L的單一溶液，在相同儀器條件下用本方法進行掃描平行測定11次熒光強度，得到色氨酸﹑酪氨酸﹑苯丙氨酸的相對標準偏差分別為0.55%、0.73%、1.4%。

2.8 實際樣品的測定

采用加標回收法，考察不同濃度比的色氨酸﹑酪氨酸和苯丙氨酸在實際樣中的回收率。分別取3.0mL自來水﹑金駱駝酒和河套老窖酒各3份，分別加入3.0mL NaH2PO4-NaOH緩沖液，再加入不同濃度比的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸溶液，用二次蒸餾水稀至刻度，然后以激發波長為265nm進行掃描發射光譜，用OSCWPT-PLS方法進行計算，結果見表7。

表7 實際樣品的濃度及回收率Table 7 Actual concentrations, determined concentrations and recovery rates of tyrosine, tryptophan and phenylalanine in real samples

2.9 干擾實驗

實驗表明，常見無機離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Al3+、SO42-、CO32-、PO43-、NO3-、Cl-等和賴氨酸﹑蘇氨酸﹑蛋氨酸﹑組氨酸﹑半胱氨酸都在相對誤差±5%范圍內，不影響測定。

3 結 論

應用OSC-WPT-PLS 法對熒光激發，發射光譜嚴重重疊的色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸3組分混合體系進行同時測定，并與WPT-PLS 和 PLS 2種方法進行比較。3種方法(OSC-WPT-PLS，WPT-PLS 和PLS)的RSEP 分別為2.80%、4.35% 和5.14%。該法用于測定自來水及內蒙產的金駱駝酒和河套老窖酒中3種氨基酸含量的測定，其回收率分別為96.9%～103.2%、94.1%～105.4%和95.3%～107.8%。

[1]高玲, 任守信. 小波包變換潛變量回歸同時測定錳鋅鈷[J]. 冶金分析, 2003, 23(3)∶ 1-5.

[2]HAO Yong, CAI Wensheng, SHAO Xueguang. A strategy for enhancing the quantitative determination ability of the diffuse reflectance nearinfrared spectroscopy[J]. Spectrochim Acta Part A, 2009, 72(1)∶ 115-119.

[3]NI Yongnian, WANG Yong , KOKOT S. Simultaneous kinetic spectrophotometric analysis of five synthetic food colorants with the aid of chemometrics[J]. Talanta, 2009, 78(2)∶ 432-441.

[4]GAO Ling, REN Shouxin. Simultaneous spectrophotometric determination of four metals by two kinds of partial least squares method[J]. Spectrochim Acta∶ A, 2005, 61(13/14)∶ 3013-3019.

[5]何錫文, 唐志新, 楊萬龍, 等. 優化目標轉換因子法[J]. 分析化學, 1994, 22(3)∶ 218-222.

[6]倪永年, 黃春芳. 化學計量學在食品分析中的應用與進展[J]. 食品科學, 2003, 24(2)∶ 154-158.

[7]陸曉華, 施文趙. 化學計量學[J]. 自然雜志, 1992, 15(4)∶ 286-289.

[8]陳國珍. 熒光分析法[M]. 北京∶ 科學出版社, 1990∶ 10-15.

[9]張為, 曹玉珍, 劉振宇, 等. 平行因子算法用于酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的同時定性與定量測定[J]. 化學通報, 2002(6)∶ 48-421.

[10]張晶玉, 楊金夫, 任英, 等. Kalman濾波熒光光度法同時測定酪氨酸和苯丙氨酸[J]. 光譜學與光譜分析, 1994, 14(5)∶ 5-8.

[11]梁逸曾. 白灰黑復雜多組分分析體系及其化學計量學算法[M]. 長沙∶湖南科技出版社, 1996.

[12]WESTERHUIS J A, DE JONG S, SMILDE A G. Direct orthogonal signal correction[J]. Chemometr Intell Lab Syst, 2001, 56(18)∶13-25.

[13]REN Shouxin, GAO Ling. Simultaneous quantitative analysis of overlapping spectrophotometric signals using wavelet multiresolution analysis and partial least squares[J]. Talanta, 2000, 50(6)∶ 1163-1173.

[14]COIFMAN R R, WICKERHAUSER M V. Entropy-based algorithms for best basis selection[J]. IEEE Trans Inform Theory, 1992, 38(2)∶713-718.

[15]REN Shouxin, GAO Ling. Resolve of overlapping voltammetric signals in using a wavelet packet transform based Elman recurrent neural network[J]. Electroanal Chem, 2006, 586(6)∶ 23-30.

[16]GAO Ling, REN Shouxin. Combining orthogonal signal correction and wavelet packet transform with radial basis function neural networks for multicomponent determination[J]. Chemometr Intell Lab Syst, 2001, 100(1)∶ 57-65.

[17]NAVAL N A, BLANC R, Del OLMO M, et al. Simultaneous determination of naproxen , salicylic acid and acetylsalicylic acid by spectrofluorimetry using partial least-squares (PLS) multivariate calibration [J]. Talanta, 1999, 48(2)∶ 469-475.

[18]薛永林, 任守信, 趙志超, 等. 化學計量學方法同時測定鐵、鋁和鈹[J]. 分析科學學報, 2010, 26(5)∶ 543-546.

Simultaneous Detection of 3 Amino Acids with Overlapped Fluorescent Spectra by Multi-dimensional Data Analysis

XUE Yong-lin，REN Shou-xin，ZHANG Yan-bing，GAO Ling*
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Inner Mongolia University, Huhhot 010021, China)

An orthogonal signal correction-wavelet packet transform-partial least squares (OSC-WPT-PLS) method was proposed for simultaneous detection of tryptophan, tyrosine and phenylalanine with overlapped fluorescent spectra. A program (POSCWPTPLS) was designed to execute relevant calculations and three chemometric methods (OSC-WPT-PLS, WPTPLS and PLS) were compared in this study. The relative standard errors of prediction (RSEP) were achieved for all components by using OSC-WPT-PLS, WPT-PLS and PLS were 2.80%, 4.35% and 5.14%, respectively. The OSC-WPT-PLS method revealed the best detection efficiency among three methods, which could be successfully applied to determine the contents of tryptophan, tyrosine and phenylalanine in water, Gold-Camel wine and Hetao wine made in Inner Mongolia with a recovery rate of respectively 96.9%-103.2%, 94.1%-105.4% and 95.3%-107.8%.

multi-dimensional data analysis；fluorespectrophotometry；simultaneous determination；tryptophan；tyrosine；phenylalanine

O657.3

A

1002-6630(2011)16-0290-05

2010-11-19

國家自然科學基金地區項目(21067006；0762003)；內蒙古自然科學基金項目(2009MS0209)

薛永林(1982—)，女，碩士研究生，主要從事分析化學及化學計量學研究。E-mail：xuerui7451@163.com

*通信作者：高玲(1957—)，女，高級工程師，主要從事分析化學及化學計量學研究。E-mail：lingyuxi@hotmail.com