高效液相色譜法測定母乳中唾液酸含量

陳海嬌，王 萍，陳 越，李紅衛*

(廈門大學醫學院預防醫學系，福建 廈門 361005)

高效液相色譜法測定母乳中唾液酸含量

陳海嬌，王 萍，陳 越，李紅衛*

(廈門大學醫學院預防醫學系，福建 廈門 361005)

建立熒光高效液相色譜(fluorescence detector-high performance liquid chromatography，HPLC-FLD)測定母乳中唾液酸N-乙酰神經氨酸(N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac)和N-羥乙酰神經氨酸(N-glycolyl neuraminic acid，Neu5Gc)含量的分析方法。利用酸水解法釋放出母乳中的唾液酸，以4,5-亞甲二氧基-1,2-鄰苯二胺鹽(4,5-methylenedioxy-1, 2-phenylenediamine dihydrochloride，DMB)為衍生化試劑，50℃避光衍生150min，采用熒光高效液相色譜儀檢測。色譜條件：LiChrosorb RP-18柱(250mm×4mm，5μm)，流動相為甲醇-乙腈-超純水(7∶8∶85)，流速0.9mL/min，進樣體積10μL，柱溫30℃，熒光檢測器激發波長373nm，發射波長448nm。結果表明：唾液酸在50～400μmol/L范圍內與唾液酸峰面積的線性關系良好，平均回收率為94.0%，精密度的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)為0.4%，穩定性RSD為1.0%，重復性RSD為0.8%，Neu5Ac的最低檢出限為0.02μmol/L，Neu5Gc的最低檢出限位0.03μmol/L。該方法簡單、重復性好、靈敏度高，可廣泛用于奶粉、牛奶及母乳中唾液酸含量測定。

母乳； 唾液酸； 熒光高效液相色譜(HPLC-FLD)

唾液酸(sialic acid，SA)是一族神經氨酸的氮或氧基取代的衍生物，廣泛存在于很多動物組織和體液中，是糖蛋白、低聚糖和糖脂的重要成分。在大部分哺乳動物的中樞神經系統中，尤其是大腦灰質中，唾液酸的含量相當高[1]。此外唾液酸是一種天然的營養成分，以其在母乳中的高含量而受到廣泛的關注，但在牛奶和嬰兒配方奶粉中含量卻很低[2-3]，研究證明它能促進嬰兒的認知發育、增強學習和記憶能力[4]。

母乳中的唾液酸絕大多數是Neu5Ac(圖1)，主要是以低聚糖的形式存在[2]。奶粉中的唾液酸主要是Neu5Ac，但也含有一定量的Neu5Gc(圖2)，主要是以蛋白結合形式存在[2]。雖然母乳中唾液酸的營養和生物學作用還不是很清楚，但是很多研究已證明與低聚糖結合的唾液酸的抗菌能力[1,5]。也有研究發現外源性唾液酸有助于嬰兒期的大腦發育和學習記憶能力[1]。目前，市售配方奶粉已將唾液酸作為奶粉優化的一個參數，使其更接近母乳的黃金標準。因此，在研究中需要找到一種簡單可靠方法來測定母乳中唾液酸含量，為配方奶的生產提供參考。

目前定量檢測總唾液酸的方法有很多，例如傳統的基于比色法的間苯二酚法[6]或硫巴比安酸法[7]。牛奶和嬰兒配方奶粉中唾液酸的檢測方法仍然普遍使用比色法。但是這些方法相對來說都比較耗時耗力，成本較高，而且精密度較低。脈沖電化學高效陰離子交換色譜檢測法(high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection，HPAE-PAD)也用于唾液酸分析[8]，并且用于奶中唾液酸的檢測[9]。此外，也有用紫外高效液相色譜法(ultraviolet detector-high performance liquid chromatography，HPLC-UV)測定奶粉中唾液含量的報道[10]。唾液酸是一種碳水合物，在自然界中主要是以結合的形式與黏多糖、糖蛋白和糖脂中的低聚糖鏈相連，像牛奶、配方奶粉和母乳中所含有的大量乳糖、半乳糖、低聚糖等碳水化物復雜基質，酸解后所釋放的唾液酸，與這些糖類混合在一起而很難達到檢測所要求的分離度[11]。本研究的目的是建立一種DMB衍生化的HPLC-FLD檢測方法，可以準確快速的測定母乳中唾液酸的含量。

圖2 Neu5Gc的結構Fig.2 Structure of Neu5Gc

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10份初乳(產后第3天)，采自于廈門市婦幼保健院正常產的健康產婦；所有用水均為超純水；4,5-亞甲二氧基-1,2-鄰苯二胺鹽酸鹽(4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediamine di hydrochloride，DMB)、Neu5Ac、Neu5Gc標準品 美國Sigma公司；甲醇與乙腈均為色譜純 韓國SK Chemical 公司；硫酸、三氟乙酸、三氯乙酸、冰醋酸、亞硫酸鈉、硫代硫酸鈉、2-巰基乙醇(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent-1200型HPLC儀(帶熒光檢測器) 美國Agilent公司；色譜柱：LiChrosorb RP-18 柱(250mm×4mm，5μm) 德國默克公司；0.22μm微孔濾膜 上海楚定分析儀器有限公司；超速冷凍離心機 美國Sigma公司。

1.3 色譜檢測條件

色譜柱：LiChrosorb RP-18柱(250mm×4mm，5μm)，柱溫30℃；熒光檢測器激發波長373nm，發射波長448nm；流動相為甲醇-乙腈-超純水(7∶8∶85)；流速為0.9mL/min；進樣體積10μL。

DMB衍生液：8mmol/L DMB，1.5mol/L冰醋酸，0.25mol/L硫代硫酸鈉，0.25mol/L亞硫酸鈉，0.8mmol/L 2-巰基乙醇。

衍生條件：90μL樣品或標準品中加入10μL DMB衍生液，50℃避光衍生150min，冷卻至室溫后進行液譜分析。

1.4 母乳樣品溶液的制備[2,12]

1.4.1 游離和低聚糖結合唾液酸含量的測定

準確量取500μL乳汁于離心管中，加入等體積的10%的三氯乙酸溶液沉淀蛋白，混勻后冰浴10 m in，再離心30min，將上清液移入新的離心管，于沉淀中加入500μL冷的5%的三氯乙酸洗滌，混勻后在4℃、3000r/min 離心30min，吸取上清液到第1次的上清中，即合并兩次上清液。合并的上清液加入等體積0.1mol/L三氟乙酸80℃水解30min，取出后冷卻, 經0.22μm濾膜過濾，精確吸取過濾后的溶液90μL，加10μL DMB 50℃避光衍生150min，冷卻后進行液譜分析，此為母乳中游離的和與低聚糖結合的唾液酸之和。

1.4.2 蛋白結合唾液酸含量的測定

于1.4.1節處理后的沉淀中加入2mL(0.05mol/L)硫酸，80℃水解120min，取出后冷卻, 經0.22μm濾膜過濾，精確吸取過濾后的溶液90μL，加10μL DM B 50℃避光衍生150min，冷卻后按色譜條件分析。

1.4.3 總唾液酸含量

雖然唾液酸也有少部分以糖脂(神經節苷脂)的形式存在，但是在母乳總唾液酸含量中所占的比例卻很低(＜0.5%)[13]，所以本研究未單獨檢測(包含于游離和與低聚糖結合唾液酸中)。母乳中總唾液酸含量即為游離的、與低聚糖結合的和與蛋白結合的唾液酸含量之和。

1.5 唾液酸的定性與定量

通過比較標準品和樣品中唾液酸的保留時間定性，根據唾液酸的標準曲線來計算母乳中唾液酸的含量。

2 結果與分析

2.1 唾液酸的衍生化原理

唾液酸本身不具有熒光，但其在酸性條件下能與DMB衍生液衍生生成DMB衍生物[14](圖3)，該衍生物經373nm激發光激發后，在484nm能夠產生可辨識可定量的較強熒光信號，從而在色譜儀中被識別并產生唾液酸的圖譜。

圖3 Neu5Ac和DMB的衍生化原理Fig.3 Derivatization principles of Neu5Ac and DMB

2.2 唾液酸的色譜圖

圖4為Neu5Ac和Neu5Gc標準品溶液的色譜圖，Neu5Ac的保留時間為13.778min，Neu5Gc的保留時間為9.855min。圖5、6分別為母乳中游離唾液酸和與低聚糖結合的唾液酸、與蛋白質結合的唾液酸的色譜圖，據標準品的保留時間可判定圖5中13.753min和圖6中13.750min的色譜峰分別對應的是母乳中游離的和經酸解后釋放的與低聚糖結合的和與蛋白質結合的Neu5Ac的色譜峰。采用本方法檢測母乳樣品時未檢測到Neu5Gc。

圖4 Neu5Ac和Neu5Gc標準色譜圖Fig.4 Chromatograms of standard Neu5Ac and Neu5Gc

圖5 母乳中游離的唾液酸和低聚糖結合唾液酸色譜圖Fig.5 Chromatograms of free and oligosaccharide-bound sialic acid in human milk

圖6 母乳中蛋白結合唾液酸色譜圖Fig.6 Chromatograms of protein-bound sialic acid in human milk

2.3 線性實驗結果

表1 唾液酸標準曲線數據Table 1 Data for preparing standard curve of sialic acid

圖7 Neu5Ac與Neu5Gc唾液酸含量標準曲線圖Fig.7 Standard curves of Neu5Ac and Neu5Gc

精確稱取0.0309g Neu5Ac和0.0325g Neu5Gc標準品粉末，分別溶解于100mL超純水中，配成1mmol/L的Neu5Ac和1mmol/L的Neu5Gc標準品溶液。分別取濃度為1mmol/L的兩種標液5、10、20、30、40μL按照表1配成待衍生的混合液，50℃衍生150min后HPLC檢測，不同濃度標準品進樣2次。以2次峰面積的平均值為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標繪制標準曲線，計算標準曲線方程，如圖7，標準品在50～400μmol/L濃度范圍內，與峰面積的線性關系較好。

2.4 回收率實驗

取3份初乳，加入一定量的Neu5Ac標準品溶液，與樣品同樣實驗方法測定唾液酸總量，回收率見表2。平均回收率為94.0%，表明樣品處理過程中Neu5Ac損失較少。

表2 HPLC-FLD法測定唾液酸的回收率Table 2 Spike recovery rates of sialic acid in human colostrum determined by HPLC-FLD

2.5 精密度實驗

取 200μmol/L Neu5Ac標準品溶液，衍生后重復進樣測定6次，測得6次峰面積分別為：3946、3964、3980、3979、3967和3951，計算得相對標準偏差(relative standard de viation，RSD)為0.4%，精密度較好。

2.6 穩定性實驗

取同一份樣品溶液，分別于其衍生后0、1、2、4、6、8、10h測定其峰面積，得峰面積分別為9726、9723、9625、9820、9539、9623和9568，計算得RSD為1.0%，表明該樣品衍生后在10h內穩定。

2.7 重復性實驗

分別量取同一個人的初乳，共6份，按樣品溶液的處理方法處理后進樣，得6個峰面積分別為7456、7436、7320、7459、7468和7489，計算得RSD為0.8%，表明該方法重復性良好。

2.8 最低檢出限實驗

取Neu5Ac和Neu5Gc標準品溶液，加水倍比稀釋，按照標準品處理方法測定，直至被測標準品濃度所對應信噪比為3，按公式D1=3NW/A計算最低檢測限(D1為最低檢測限，N為噪音峰高，W為進樣質量濃度，A為標準品峰高)。結果Neu5Ac的最低檢出限為0.02μmol/L，Neu5Gc的最低檢出限為0.03μmol/L。

2.9 母乳中唾液酸含量

取10份初乳樣品，按1.4.1、1.4.2和1.4.3節方法處理后，根據峰面積，按外標法計算其含量，10份母乳唾液酸的平均含量為2157.46mg/L。

3 討論和結論

本方法能同時對Neu5Ac和Neu5Gc進行分析，兩者可以實現很好的分離。依本方法，母乳中只檢測到Neu5Ac，而未檢測到Neu5Gc。

比色法和色譜光度測量法等傳統方法是用離子交換柱純化酸水解樣品后的唾液酸[15]，這種方法樣品中唾液酸損失較大，影響檢測的準確性。本研究方法的樣品處理過程不需要對唾液酸進行純化，操作方便簡單，避免了唾液酸的損失和O-乙酰基的異構化，從而提高了回收率。本實驗方法最主要的特點在于DMB與唾液酸的特異反應，其特異性消除了母乳中乳糖等復雜物質對唾液酸檢測的影響。用間苯二酚、硫巴比安酸和酶裂解這3種方法檢測生物組織中的唾液酸，其最低檢出限分別是0.12、0.20mmol/L和0.06mmol/L，重復性RSD分別為4.5%，3.1%和4.0%[16]，而本方法中Neu5Ac的最低檢出限為0.02μmol/L，Neu5Gc的最低檢出限為0.03μmol/L，重復性RSD為0.8%，可見本研究方法能使唾液酸含量較低的樣品也可以被檢出，重復性更好。

總之，通過線性、回收率、精密度、穩定性、重復性、最低檢出限和樣品的測定，充分驗證了本方法的可行性，可廣泛用于奶粉、牛奶及母乳中唾液酸的含量測定。

[1]WANG Bing, BRAND J. The role and potenial of sialic acid in human nutrition [J]. European Journal of Clinical Nutrition, 2003, 57(11)∶ 1351-1369.

[2]WANG Bing, JANETTE B M, PATRICIA M, et al. Concentration and distribution of sialic acid in human milk and infant formulas[J]. Am J Clin Nutr, 2001,74(4)∶ 510-515.

[3]MARTIN-SOSA S, MARTIN M J, GARCIA-PARDO L A, et al. Sialyloligosaccharideds in human and bovine milk and infant formulas∶variations with the progression of lactation[J]. American Dairy Science Association, 2003, 86(1)∶ 52-59.

[4]WANG Bing. Sialic acid is an essential nutrient for brain development and cognition[J]. Annu Rev Nutr, 2009, 29∶ 177-222.

[5]KUNZ C RUDLOFF S. Potential anti-infammatory and anti-infectious effects of human milk oligosaccharides[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology, 2008, 606∶ 455-465.

[6]SVENNERHOLM L. Quantitative estimation of sialic acids-Ⅱ.A colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method[J]. Biochimica Biophysica Acta, 1957, 24(3)∶ 604-611.

[7]WARREN L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1959, 234(8)∶ 1971-1975.

[8]ROHRER J S. Analyzing sialic acids using high-performance anionexchange chromatography with pulsed amperometric detection[J]. Analytical Biochemistry, 2000, 283(1)∶ 3-9.

[9]TANG Kuntian, LIANG Lina, CAI Yaqi, et al. Determination of sialic acid in milk and products using high performance anion-exchange chromatography coupled with pulsed amperometric detection[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2008, 36(11)∶ 1535-1538.

[10]馮君, 李宏基, 韓立強, 等. 牛奶中唾液酸含量的動態變化規律研究[J]. 食品科技, 2008(4)∶ 85-87.

[11]SORENSEN L K. Determination of sialic acid in infant formula by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Biomed Chromatogr, 2010, 24(11)∶ 1208-1212.

[12]黃華軍, 奚星林, 吳宏中, 等. 奶粉中唾液酸的測定方法[J]. 分析測試學報, 2006, 25(4)∶ 129-131.

[13]RUDEA R, MALDONADO J, GIL A. Comparison of content and distribution of human milk gangliosides from Spanish and Panamanian mothers [J]. Ann Nutr Metab, 1996, 40(4)∶ 194-201.

[14]LIN S L, INOUE S, INOUE Y. Acid-base properties of the reaction product of sialic acid with fluorogenic reagent, 1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene (DMB)[J]. Carbohydrate Research, 2000, 329 (2)∶ 447-451.

[15]SIEBERT H C, KAPTEIN R, BEINTEMA J J, et al. Carbohydrateprotein interaction studies by laser photo CIDNP NMR methods[J]. Glycoconj J, 1997, 14(4)∶ 531-534.

[16]LACOMBA R, SALCEDO J, ALEGRIA A, et al. Determination of sialic acid and gangliosides in biological samples and dairy products∶ A review[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2010, 51 (2)∶ 346-357.

Determination of Total Sialic Acid Content in Human Milk by HPLC-FLD

CHEN Hai-jiao，WANG Ping，CHEN Yue，LI Hong-wei*
(Department of Preventive Medicine, Medical College, Xiamen University, Xiamen 361005, China)

An analytical method was developed for determining total content of sialic acids including N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) and N-glycolyl neuraminic acid (Neu5Gc) in human milk. Sialic acid in human milk was released by acid hydrolysis, and derivatized with 4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride at 50 ℃ for 150 min in a dark environment. The separation of sialic acid was achieved on LiChrosorb RP-18 column (250 mm × 4 mm, 5μ m) using methanol-acetonitrile-water (7∶8∶85) as the mobile phase at a flow rate of 0.9 mL/min. Injection volume and column temperature were set at 10μ L and 30 ℃, respectively. The fluorescence excitation and emission wavelengths were 373 nm and 448 nm, respectively. The results showed that the linear range of sialic acid was 50-400μ mol/L. The average recovery rate was 94.0%. The precision, stability and repeatability RSDs were 0.4%, 1.0% and 0.8%, respectively. The limits of detection were 0.02μ mol/L for Neu5Ac and 0.03μ mol/L for Neu5Gc. Therefore, this developed method is characteristics of simple operation, and high reproducibility and sensitivity. It can be widely applied to determine total content of sialic acid in infant formula, cow milk and human milk.

human milk；sialic acid；fluorescence high performance liquid chromatography

TS252.2

A

1002-6630(2011)16-0308-04

2010-11-23

陳海嬌(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為營養學。E-mail：Jessichen2010@hotmail.com

*通信作者：李紅衛(1967—)，男，副教授，博士，研究方向為營養學。E-mail：rocque@xmu.edu.cn