四種蜂蜜中脂肪酸的氣相色譜-質譜分析

朱曉玲，朱婕妤，朱 露，文 紅*，劉 睿,*

(1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.武漢市蜂產品質量控制工程技術研究中心，湖北 武漢 430070；3.湖北省產品質量監督檢驗研究院，湖北 武漢 430061)

四種蜂蜜中脂肪酸的氣相色譜-質譜分析

朱曉玲1,2，朱婕妤1,2，朱 露1,2，文 紅2,3,*，劉 睿1,2,*

(1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.武漢市蜂產品質量控制工程技術研究中心，湖北 武漢 430070；3.湖北省產品質量監督檢驗研究院，湖北 武漢 430061)

對湖北產荊條蜜、紫云英蜜、柑橘蜜、油菜蜜4個蜂蜜品種中的脂肪酸組成和含量進行分析比較。采用乙醚提取蜂蜜中的脂肪酸，再以硫酸-甲醇溶液進行甲酯化處理，通過氣相色譜-質譜聯用儀分離鑒定其中的脂肪酸組成和相對含量。結果表明，4種蜂蜜中共分離出14種脂肪酸，其中荊條蜜、紫云英蜜及油菜蜜中分別鑒定出8種脂肪酸，柑橘蜜中鑒定出7種脂肪酸，另外，14種脂肪酸中不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的45.53%～79.31%，飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的16.68%～40.77%，4種蜂蜜中均含有棕櫚酸和油酸。

蜂蜜；脂肪酸；氣相色譜-質譜

蜂蜜是指蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結合后，經充分釀造而成的天然甜物質[1]，是一種傳統的天然保健食品，其中富含葡萄糖、果糖，以及酶、維生素、礦物質等多種微量成分[2]，營養十分豐富，具有較好的生理功能和藥理活性[3]。

我國是世界養蜂大國，我國的蜂群數量和蜂蜜產量均居世界首位，蜂蜜出口量和出口額都居世界前列[4]。隨著蜂蜜用途的不斷擴大以及蜂蜜消費量的逐年增加，對其中各種營養成分、功能因子以及質量安全問題的研究也在不斷深入，包括糖的組成與含量[5-6]，黃酮[7]、酚酸的種類與含量[8]，淀粉酶活性[9]，羥甲基糠醛含量[10]，抗生素[11]、農藥殘留[12]等，但對于蜂蜜中脂肪酸的研究報道較少[13]。脂肪酸作為蜂蜜中的微量生物活性成分之一，不僅可使蜂蜜保持酸性抑制微生物的生長繁殖，更重要的是能以此構建蜂蜜指紋圖譜判定蜂蜜的植物來源，鑒定蜂蜜的真偽。目前，國外已有學者對蜂蜜中脂肪酸的指紋圖譜構建以及特征標記物的分析進行初步研究，Wilkins等[14]對新西蘭蜂蜜的脂肪族二元酸進行了分析，通過對200個新西蘭蜂蜜樣品進行研究，發現其中的2-甲基-丁二酸和4-羥基-3-甲基-反式-2-戊烯二酸僅存在于新西蘭金銀花蜜(rewarewa honey)中，可作為新西蘭金銀花蜜的標記物。本研究主要對湖北產荊條蜜、紫云英蜜、柑橘蜜、油菜蜜中的脂肪酸通過氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry，GCMS)聯用法進行分析、鑒定，并比較其中的脂肪酸組成和含量情況，為蜂蜜脂肪酸指紋圖譜的建立積累數據和提供相關依據，并為評價蜂蜜的保健和營養價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

湖北產荊條蜜、紫云英蜜、柑橘蜜、油菜蜜為湖北省武漢市小蜜蜂食品有限公司提供，并經其鑒定為單花蜂蜜。

無水乙醚、硫酸、無水甲醇(均為分析純) 國藥集團化學試劑有限公司；水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設備

6890N/5973-GC/MSD型氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫儀器公司；多功能攪拌器、HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；BL310電子天平 德國賽多利斯公司。

1.3 樣品處理

分別準確稱取荊條蜜、紫云英蜜、柑橘蜜、油菜蜜10～15g于500mL燒杯中，加蒸餾水300mL，電動攪拌15min，待混合均勻后移至500mL分液漏斗中，加入100mL無水乙醚，振搖后靜置分層，收集有機相，下層水溶液用乙醚重復萃取兩次，合并乙醚層，揮發濃縮至1mL。

1.4 脂肪酸的甲酯化

將上述乙醚提取物轉至刻度試管中，加入2mL 1%的硫酸-甲醇溶液，在50℃恒溫水浴中保溫40min，其間每隔5～8min搖晃一次，取出冷卻至室溫，加入3mL蒸餾水及2mL無水乙醚，振蕩分層，取上層清液，待GC-MS分析。

1.5 GC-MS分析條件

1.5.1 氣相色譜條件

色譜柱：HP-5彈性石英毛細管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；升溫程序：40℃保持3min，以6℃/min升至280℃，保持15min；汽化溫度：250℃；不分流進樣，進樣量1μL；溶劑延遲：3min；載氣(He)流量：1mL/ min。

1.5.2 質譜條件

電子轟擊(electron impact，EI)離子源；電子能量70eV；燈絲發熱電流0.25mA；電子倍增器電壓1000V；離子源溫度：200℃；接口溫度：250℃；質量掃描范圍：m/z40～550。

1.6 測定方法

1.6.1 定性分析

取經1.3、1.4節處理的樣品1μL，用氣相色譜-質譜聯用儀進行分析鑒定。通過G170LBA 化學工作站數據處理系統及NIST98標準質譜譜庫做數據處理和化合物檢索，根據與質譜譜庫中質譜數據匹配度的大小和脂肪酸甲酯的質譜斷裂規律，結合人工質譜解析確定樣品中各化學成分。

1.6.2 定量分析

通過G170LBA化學工作站數據處理系統，按峰面積歸一化法進行定量分析，分別求得各化學成分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 脂肪酸定性分析

圖1 4種蜂蜜中脂肪酸的GC-MS總離子流圖Fig.1 Total ion current GC-MS chromatogram of fatty acids in 4 kinds of honey

4種蜂蜜中脂肪酸甲酯的總離子流如圖1所示。按面積歸一化法進行定量分析，蜂蜜中的脂肪酸及各脂肪酸的相對含量列于表1～4。

表1 荊條蜜中脂肪酸的鑒定結果Table 1 Fatty acids and their relative contents identified in chaste tree honey

表2 紫云英蜜中脂肪酸的鑒定結果Table 2 Fatty acids and their relative contents identified in clover honey

表3 柑橘蜜中脂肪酸的鑒定結果Table 3 Fatty acids and their relative contents identified in citrus honey

表4 油菜蜜中脂肪酸的鑒定結果Table 4 Fatty acids and their relative contents identified in rape honey

由表1～4可知，經計算機檢索得到4種植物源蜂蜜中所含化合物的組成情況，但表中部分化合物的相似度較低，僅僅通過質譜匹配將很難對其進行準確定性，如表2中保留時間(retention time，RT) 32.718min的色譜峰所對應化合物的相似度為64%，表3中RT 32.684min的色譜峰所對應化合物的相似度為59%等，因此本實驗對表1～4中相似度較低(小于90%)的物質所對應的質譜圖進行人工解析以達到準確定性的目的。根據脂肪酸甲酯的裂解規律，采用特征碎片離子對脂肪酸甲酯碳數及雙鍵數目加以確認。沈宏林等[15-16]指出在脂肪酸碎裂過程中具有以下質譜特征：飽和脂肪酸酯易發生C—C鍵斷裂失去烴基(—C3H7)，得到[M-43]+的離子，同時易發生麥氏重排給出m/z 74(—CH3OC(OH)＝CH2)的碎片離子，以十六烷酸甲酯為例的質譜碎裂具體過程見圖2。

圖2 十六烷酸甲酯碎裂途徑[16]Fig.2 Fragmentation pathway of palmitic acid methyl ester

另外，單不飽和脂肪酸酯易發生γ氫轉移及i誘導斷裂產生[M-32]+離子，并同時雙鍵遷移發生α斷裂產生-C4H7+的碎片離子m/z 55；雙不飽和脂肪酸酯易發生羰基α斷裂產生[M-31]+離子，雙鍵遷移進行α斷裂產生-C5H7+的碎片離子m/z 67[15-16]。

因此，本實驗根據上述脂肪酸甲酯的質譜碎裂特征規律及相關文獻[15-16]中脂肪酸甲酯的碎片離子特征，對表1～4中相似度低于90%的物質進行解析，其中表2中相似度為89%的RT 35.542min色譜峰所對應物質的質譜圖見圖3。

圖3 表2中RT 35.542min色譜峰的質譜圖Fig.3 Mass spectrum of the fraction with retention time of 35.542 min in Table 2

由圖3可知，此物質的主要碎片離子為m/z 74、87、143、199、255、298，基峰離子為m/z 74，并同時出現m/z 255，即[M-43]+碎片離子，根據上述脂肪酸甲酯質譜碎裂特征可見，此物質質譜碎片中出現了飽和脂肪酸甲酯的特征碎片，因此可初步判斷其為飽和脂肪酸甲酯，由分子離子峰298，可初步計算此物質為C17H35COOCH3，即所對應的化合物為C17H35COOH(十八烷酸)。為進一步確認其結構，結合脂肪酸甲酯裂解的主要碎片離子產生機理對質譜圖中的主要碎片離子進行解析，解析結果見表5。從表5可找出各個碎片離子的具體歸屬，即可進一步判斷其為十八烷酸甲酯。

表5 表2中RT 35.542min色譜峰的主要質譜碎片離子解析Table 5 Analysis of major MS fragment ions from the fraction with retention time of 35.542 min in Table 2

表3中相似度為86%的色譜峰(RT 30.796min)對應物質的主要碎片離子為m/z 55、74、98、125、138、157、199，與CAS數據庫中報道的癸二酸二甲酯的主要碎片離子相同，因此可判斷其為癸二酸二甲酯，所對應的化合物為癸二酸；表2中相似度為64%的色譜峰(RT 32.718min)所對應物質的質譜主要碎片離子為m/z 57、71、85、97、101，基峰離子為m/z 57，未出現脂肪酸甲酯的特征碎片離子，因此可判斷其不是脂肪酸甲酯；同理，可得出表3中RT 32.684m in色譜峰所對應物質及表4中RT 40.277min色譜峰所對應物質均不是脂肪酸甲酯。

由此可見，通過計算機檢索以及人工解析，在四種蜂蜜中共鑒定出14種脂肪酸，其中荊條蜜、紫云英蜜及油菜蜜中分別鑒定出8種脂肪酸，柑橘蜜中共鑒定出7種脂肪酸，4種蜂蜜中均含有十六烷酸(棕櫚酸)、順-9-十八碳烯酸(油酸)。

2.24 種蜂蜜脂肪酸組成的定量分析

2.2.1 荊條蜜中脂肪酸定量分析

通過上述定性分析及計算機工作站數據處理系統按面積歸一化法所得各組分的含量，可知荊條蜜中脂肪酸含量占檢出物質總量的65.59%，其中直鏈飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的40.77%，主要是棕櫚酸和十八烷酸(硬脂酸)，分別占總脂肪酸含量的21.33%和18.16%；不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的57.97%，主要為反式-9-十八碳烯酸(反油酸)和油酸，分別占總脂肪酸含量的46.65%和4.37%；另外，還含有少量苯甲酸，占總脂肪酸含量的1.26%。

2.2.2 紫云英蜜中脂肪酸定量分析

紫云英蜜中脂肪酸含量占檢出物質總量的42.56%，其中飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的30.85%，主要由棕櫚酸、硬脂酸和十七烷酸組成，分別占總脂肪酸含量的16.60%、8.23%和3.31%；不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的69.15%，主要是油酸、8-十八碳烯酸和8,11-十八碳二烯酸，分別占總脂肪酸含量的26.46%、37.30%和5.39%。

2.2.3 柑橘蜜中脂肪酸定量分析

柑橘蜜中脂肪酸含量占檢出物質總量的29.87%，其中直鏈飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸分別占總脂肪酸含量的38.71%、45.53%，主要為棕櫚酸(占總脂肪酸含量的21.15%)、十七烷酸(占總脂肪酸含量的8.44%)、反油酸(占總脂肪酸含量的27.89%)、油酸(占總脂肪酸含量的14.74%)。另外，還含苯甲酸，占總脂肪酸含量的15.77%。

2.2.4 油菜蜜中脂肪酸定量分析

油菜蜜中脂肪酸含量占檢出物質總量的64.22%，其中直鏈飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的16.68%，主要含棕櫚酸(占總脂肪酸含量的13.39%)、硬脂酸(占總脂肪酸含量的3.28%)；不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的79.31%，主要為7-十八烯酸(占總脂肪酸含量的65.18%)、8,11-十八碳二烯酸(占總脂肪酸含量的9.72%)、油酸(占總脂肪酸含量的4.41%)；另外，還含苯甲酸占總脂肪酸含量的3.91 %。

通過對湖北產4種不同植物源蜂蜜脂肪酸組成進行分析，共鑒定出14種脂肪酸，其中含量較高的包括棕櫚酸、硬脂酸、反油酸、油酸、8-十八碳烯酸、7-十八碳烯酸；4個蜂蜜品種中均含有棕櫚酸和油酸，其中棕櫚酸含量最高的是荊條蜜，含量達21.33%，油酸含量最高的是紫云英蜜，含量達26.46%。另外，在荊條蜜及柑橘蜜中鑒定出反油酸且含量較高，而在另外兩種蜜中未檢出；在荊條蜜、柑橘蜜及油菜蜜中鑒定出苯甲酸，而紫云英蜜中未出現；在油菜蜜中還檢出少量二十烷酸(花生酸)，另外3種蜜中均未檢出，表明不同植物源蜂蜜中脂肪酸在組成及含量上均存在一定的差異。

4種蜂蜜中除柑橘蜜中不飽和脂肪酸含量占總脂肪酸的45.53%，其他蜂蜜中不飽和脂肪酸所占比例均在50%以上，主要以7-十八烯酸、8-十八碳烯酸和油酸為主；其中不飽和脂肪酸含量最高的是油菜蜜，含量達79.31%，其次是紫云英蜜，含量達69.15%。而4種蜂蜜中飽和脂肪酸以棕櫚酸、硬脂酸為主，含量最高的是荊條蜜，其占總脂肪酸含量的40.77%。另外，在荊條蜜、柑橘蜜及油菜蜜中鑒定出苯甲酸，含量最高的是柑橘蜜，占總脂肪酸含量的15.7%。

3 結 論

本研究采用乙醚提取蜂蜜中的脂肪酸，經甲酯化處理，用氣相色譜-質譜聯用儀分析，荊條蜜、紫云英蜜、柑橘蜜、油菜蜜4種蜂蜜中共鑒定出14種脂肪酸，荊條蜜、紫云英蜜及油菜蜜中分別含有8種，柑橘蜜中含有7種。其中油菜蜜中不飽和脂肪酸含量最高，達79.31%，荊條蜜中飽和脂肪酸含量最高，達40.77%，4種蜂蜜中均含有棕櫚酸和油酸，荊條蜜、柑橘蜜及油菜蜜中均含有苯甲酸，另外還含有其他種類的含量較少的脂肪酸如：油菜蜜中含有花生酸占總脂肪酸的0.46%等。研究表明：不同植物源蜂蜜中脂肪酸在組成及含量上均存在一定的差異。本研究可為蜂蜜中脂肪酸指紋圖譜的建立提供數據積累和研究依據。

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GC-MS Analysis of Fatty Acids in Four Kinds of Honey

ZHU Xiao-ling1,2，ZHU Jie-yu1,2，ZHU Lu1,2， WEN Hong2,3,*，LIU Rui1,2,*
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China；2. Wuhan Research Center on Quality Control Engineering of Bee Products, Wuhan 430070, China；3. Hubei Provincial Supervision and Inspection Research Institute for Product Quality, Wuhan 430061, China)

The composition and contents of fatty acids in four kinds of honey such as chaste tree honey, clover honey, citrus honey and rape honey collected from Hubei province were comparatively analyzed. Fatty acids were extracted by ether and esterified with 1% sulfuric acid-methanol, and then analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Totally 14 fatty acids were identified in four kinds of honey, of which 8 were isolated from chaste tree honey, clover honey and rape honey, and 7 were isolated from citrus honey. Moreover, the content of unsaturated fatty acids accounted for 45.53%-79.31% of total fatty acids, while saturated fatty acids accounted for 16.68%-40.77 %. Palmitic acid and oleic acid were detected in each kind of honey.

honey；fatty acid；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

TS207.3

A

1002-6630(2011)16-0338-05

2010-12-08

武漢市科技局工程技術研究中心項目(200920137007)；中央高校基本科研業務費專項資金資助項目(200922；2010PY015)；華中農業大學校SRF項目(A059)

朱曉玲(1987—)，女，碩士，研究方向為蜂產品加工及蜂產品質量控制。E-mail：chuandian1987@yahoo.com.cn

*通信作者：文紅(1971—)，女，高級工程師，碩士，研究方向為食品質量分析。E-mail：wen_red@sina.com劉睿(1969—)，男，副教授，博士，研究方向為蜂產品加工及蜂產品質量控制。E-mail：liurui@mail.hzau.edu.cn