明理、細察、分析
——淺談質粒提取實驗的幾個教學關鍵點

韋明肯 (玉林師范學院生命科學與技術學院,廣西玉林537000)

李長秀 (玉林師范學院圖書館,廣西玉林537000)

梁 鈴 (長江大學生命科學學院,湖北荊州434023)

質粒提取是分子生物學實驗的基礎技能和基本要求,正確掌握質粒提取純化的原理和技巧對學生的進一步學習和深造具有重要意義。由于質粒是最常用的基因工程載體,質粒提取質量的好壞直接影響到酶切、連接、轉化等后續實驗,因此通過實驗課培養學生扎實的質粒DNA提取和純化技能對學生日后的學習和工作具有十分重要的意義。由于本科生的分子生物學實驗內容多、時間緊以及受儀器數量的限制,失敗的實驗一般沒有機會重復,所以通過有限的教學實驗達到理論和實踐的雙重提高是質粒提取實驗教學中的難題。以往的教改研究往往更偏重于質粒提取技術方法的選擇和組合等[1],但教學實踐中本課題組發現,僅有好的方法并不一定達到好的教學效果,一些學生取得了好的實驗結果但并不代表其真正理解了實驗。在有限的教學時間內,培養學生從原理上把握實驗,通過一些關鍵試劑的作用對一些關鍵現象進行解釋的能力甚至比實驗本身的成功更為重要。探索表明,從原理的把握、現象的觀察和結果分析3個角度進行質量控制可以有效提高教學質量。簡而言之,即 “明理”、“細察”和 “分析”。

1 質粒提取的原理

從細胞被裂解后混雜的體系中把質粒DNA單獨提取出來對于學生來講是件很奇妙的事情,而搞清楚提取的原理是學生消除神秘感和理解實驗的前提。在提取質粒時,需要把細菌的整個細胞裂解,讓包括染色體DNA、質粒DNA、RNA和蛋白質在內的所有細胞內容物完全釋放出來。因此首先必須弄清楚質粒DNA和染色體DNA以及蛋白質分離的原理。學習的重點和難點是為什么染色體DNA和質粒DNA能被分開?即同為DNA,在經過一系列的處理后為什么質粒DNA能留下來而染色體DNA卻被除去?其中的原理涉及到質粒DNA分子的大小、二級結構等信息,以及DNA的變性、復性與pH之間的關系等。明白這些原理之后,學生在實驗過程中才掌握各個步驟之間的因果關系,有利于學生對實驗進程控制和對結果進行評價、判讀。為了確保學生的學習效果,教師在實驗課開始前布置任務,并在實驗開始前抽樣檢查,要求學生必須能回答有關實驗原理的問題,對于不認真預習的學生應將其實驗推遲。總之,一定要讓學生進入實驗室前明白實驗原理。

2 主要試劑的作用原理

2.1 氫氧化鈉的作用

實驗室中常用堿裂解法小量提取質粒,因此堿裂解法是學生必須掌握的一種細胞裂解方法。教材中一般很少提及氫氧化鈉裂解細胞的原理,也很少提及為什么在提質粒時選擇堿裂解法而不是其它的細胞裂解法。氫氧化鈉的作用既能裂解細胞讓細胞內含物釋放出來,又是質粒DNA和染色體DNA得以分離的關鍵,因此必須向學生闡明此問題。在堿裂解法中,氫氧化鈉的作用原理是使細胞膜由脂雙層結構向囊泡化轉變,從而使細胞裂解。但是對革蘭氏陽性菌來說,提取質粒時不能直接使用堿裂解法,而是先用溶菌酶將肽聚糖層消化,然后才用堿裂解法裂解細胞。雖然在教學實驗中不一定進行革蘭氏陽性菌的質粒提取,但是教師可以通過介紹革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌處理方法的不同,引導學生復習有關細菌細胞壁結構的差異,讓學生深刻認識到理論課中關于細胞壁成分的組成和結構的知識并不枯燥,而是有著很強的實際應用價值。

另外一個問題是:為什么要用堿法裂解細胞呢?裂解細菌細胞的方法很多,有熱裂解法、超聲波破碎法、液氮研磨法、反復凍融法、SDS裂解法等等。而堿裂解法在提取質粒時具有一箭雙雕的作用:一方面是將細胞裂解,另一方面是形成高堿性的環境,使染色體DNA和質粒DNA變性,為下一步質粒DNA的復性及與染色體DNA分離做準備。

通過理論闡釋,督促學生更深入地了解革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌細胞壁結構的區別及特點,認識到細胞的裂解方法有很多種,并從理論上認識選擇堿裂解法的依據。

2.2 十二烷基硫酸鈉 (Sodium dodecyl sulfate,SDS)的作用

在溶液Ⅱ中既有氫氧化鈉,又有十二烷基硫酸鈉 (Sodium dodecyl sulfate,SDS),既然氫氧化鈉的作用是裂解細胞,那么SDS的作用又是什么呢?在此處應該讓學生明白,SDS其實也是一種細胞裂解劑,只是其裂解細胞的能力比氫氧化鈉要弱很多。溶液Ⅱ中有了氫氧化鈉,再加入SDS是因為SDS通常用作蛋白質的變性劑和助溶劑,它能斷裂分子內和分子間的氫鍵,使分子去折疊,破壞蛋白質的二級和三級結構。幾乎所有的蛋白質能溶解在SDS中,甚至包括疏水和變性的蛋白。DNA提取過程中,SDS使蛋白質變性后與DNA分開。

2.3 溶液Ⅲ的作用及其與溶液Ⅱ的關系

溶液Ⅲ是5mol/L的醋酸鉀溶液,pH4.8。溶液Ⅲ里既含有醋酸,也含有鉀離子,它們各自發揮作用。溶液Ⅲ不但可以中和之前溶液Ⅱ中的氫氧化鈉,還使得溶液的酸堿度劇烈下降,避免染色體DNA長時間暴露于強堿環境而斷裂 (斷裂后就不好去除了),又使得質粒可以復性。一般來說,醋酸可以中和氫氧化鈉的堿性是學生容易想得到的,但是鉀離子的作用很多學生就不明白了,而且書上介紹得不多,比如在 《分子克隆實驗指南》中,溶液Ⅲ就是醋酸鉀溶液,但沒有給出理由和解釋[2]。實際上用醋酸鉀的主要原因是溶液Ⅱ中加入了SDS來溶解蛋白,而SDS遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀 (potassium dodecylsulfate,PDS),而PDS是水不溶的,因此發生了沉淀。溶液Ⅲ加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS,而高濃度的鹽,使得沉淀更完全。由于平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子,鉀鈉離子置換所產生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質沉淀。染色體DNA容易被PDS給共沉淀了。

當然,還需要向學生說明高鹽條件也會導致SDS形成沉淀,5mol/L的醋酸鉀本身就是高鹽溶液。利用高鹽環境促進沉淀的原理,有時也可以利用10mol/L醋酸銨來代替傳統的溶液Ⅲ(即5mol/L的醋酸鉀,pH4.8)。

3 對主要實驗現象的解釋

對實驗現象的觀察和解釋關系到學生根據實驗現象判斷實驗進程是否合理、各實驗步驟完成質量以及在實驗偏離預期時采取措施進行補救的能力。對于初次接觸質粒提取實驗的學生來說,還缺少利用原理對一些實驗現象進行解釋的能力。因此,實驗課的教師應該在實驗進程中實時跟進,對實驗現象進行必要的解釋和說明。

3.1 加入溶液Ⅱ后菌液的變化及其與實驗質量的關系

加入溶液Ⅱ以后細菌迅速被裂解、菌液變得澄清,這是一個明顯而且重要的實驗現象,但是從以往考試檢查的情況看,有部分同學竟然對這樣一個細節毫無記憶,說明這些同學只是機械地按照實驗講義上的步驟進行操作,沒對實驗現象進行觀察和分析。加入溶液Ⅱ后溶液變得澄清、透明、粘稠,在操作中觀察懸液變澄清的程度可以判斷菌體是否裂解完全。如果裂解效果不好,也許是顛倒混勻的次數不夠,或者所培養的菌體被革蘭氏陽性菌或酵母菌等污染了 (革蘭氏陽性菌的堿裂解效果差),也可能是所配制的溶液出了問題。通過這樣的分析和講解引導學生學會自己分析和解決問題,并根據這些現象決定實驗是否有繼續進行的必要,有利于發揮學生做實驗的主觀能動性。從理論上來講,對這個細節觀察和解釋強化了學生對溶液Ⅱ裂解細胞作用的認識。

3.2 關于質粒電泳條帶的解釋

一般質粒電泳出現3個條帶,根據速度的快慢分別是超螺旋狀結構、開鏈環狀結構和復制中間體(即沒有復制完全的2個質粒連在一起)。對于前2條帶一般沒有疑議,至于最后面那條帶 (即最慢的那條帶),有些文獻中將移動最慢的那條帶認定為線狀結構[3],但酶切和電泳實驗表明線狀質粒的電泳條帶與此條帶位置不同,因此質粒電泳中這個最慢的條帶更應該是復制中間體[4]。為了說明第3條帶不是線狀質粒,要求學生在進行質粒的凝膠電泳時增設一個線狀質粒樣品 (經過單酶切作用)作為對照,讓其親自通過實驗看到線狀質粒與未酶切質粒的3條帶中的任一條帶的位置都不一樣!當然也有學生的質粒電泳跑出4條帶,多出的那一條一般是斷裂的基因組DNA,可就此引導學生回憶提取質粒時的操作是否得當?比如加入溶液Ⅱ時的操作是否太劇烈,或者是溶液Ⅲ加入的時間較遲等等。

4 實驗報告的撰寫

實驗報告集中體現了學生對實驗的理解和完成質量。由于質粒提取實驗的實驗步驟比較程式化,所以在報告中實驗步驟可以寫得簡略一些。但是實驗原理一定要求學生寫出來,對學生理解實驗也起到督促和強化的作用。實驗報告的重點應放在對現象的描述和實驗結果的分析、解釋方面。特別是對于一些沒有達到預期效果或與正常結果偏差較大的,應重點解釋并分析原因。只有把好實驗報告這個關口,學生才能真正從實驗總結中得到提高,實驗成功了知道成功在哪里,失敗了也明白失敗的原因。

基于分子生物學實驗的自身特點,本課題組嘗試實驗報告電子化,即學生只需上交電子版的實驗報告即可。由于電泳結果不方便繪圖,但可以將電泳圖直接貼在Word文檔中,因此電子實驗報告有利于學生將電泳結果等數字化信息上傳。

5 結語

培養學生解決問題的能力是所有教學的核心和最終目的。分子生物學是一門以實驗為基礎的實踐性很強的學科,只有在學生掌握理論基礎的情況下具備了自主開展實驗的能力,才能算得上教學的成功。實際上,在老師的指導下很多學生都能按照講義上的步驟提取到質量較好的質粒,但是并不是每個提取到質粒的同學都真正掌握了實驗的原理。因此老師不能認為學生提取到了質粒就沒問題。筆者在實踐中發現,以 “明理”、“細察”和 “分析”為指導思想,通過課前預習、課中講授以及課后的實驗報告3個環節的強化,能明顯提高教學質量,在期末考試中一些關鍵問題的答題正確率均有明顯提高,證明我們的這種教學思路和教學方法對提高實驗課的教學質量有比較好的應用價值。

[1]孫曉東,韓立敏,王 轉,等.質粒DNA提取方法的比較[J].陜西教育學院學報,2009,25(6):86-88.

[2]金東雁,黎孟風.分子克隆實驗指南 [M].北京:科學出版社,1992:928.

[3]劉漢明.質粒在細菌致病性中的作用與新菌苗研制的展望 [J].微生物學免疫學進展,1984,(1):5-16.

[4]滕 云.兩種質粒DNA純化方法的比較[J].牡丹江師范學院學報(自然科學版),2009,66(1):28-29.