布氏乳桿菌對青貯發酵及其效果的研究進展

洪梅，刁其玉＊，姜成鋼，閆貴龍，屠焰，張乃鋒

（1.中國農業科學院飼料研究所 農業部飼料生物技術重點實驗室，北京100081；2.河北北方學院，河北 張家口075000）

青貯飼料以其氣味芳香、柔嫩多汁而且適口性好等特點，已經被人們接受并使用，目前，我國青貯飼料產業得到了快速發展，幾乎所有的大、中、小型奶牛場所用的粗飼料都是以青貯飼料為主。青貯的原理是在厭氧條件下，通過附著于植物體的乳酸菌利用原料中的可溶性碳水化合物，發酵產生有機酸（主要是乳酸），迅速降低pH值，從而殺滅或抑制各種微生物的活動，達到長期保存青綠飼料的目的［1］。隨著青貯飼料產業的發展，人們基本已經能夠制作優質青貯飼料，但是，飼料的腐敗變質卻一直是生產實踐中的一個較難解決的問題。

目前很多農場的青貯飼料在飼喂前和飼喂過程中都會發生不同程度的有氧腐敗。因為每次飼喂動物前取料勢必會延長飼料暴露在空氣中的時間；而在一些農戶家中，往往是每2～3天投料1次，這樣更是大大增加了青貯飼料腐敗變質的幾率。已經腐敗變質的飼料會造成營養物質的損失，而且還會產生有毒有害物質，間接影響動物的生產性能，進而降低農民的凈收入。當青貯飼料在飼喂與貯存時，一旦接觸空氣，條件性致病菌開始變得活躍，消耗飼料中的營養物質同時開始產熱，引起青貯飼料的腐敗變質。因此，在生產實踐中，盡可能減少有氧變質帶來的損失、提高青貯飼料的有氧穩定性、延遲二次發酵以保持青貯料的品質具有重要意義。有研究發現，有些酵母菌如假絲酵母、隱球酵母以及畢赤酵母屬等，能夠利用乳酸，引起飼料pH值的升高［2，3］，它們被認為是引起青貯飼料腐敗變質的元兇，而霉菌、芽孢桿菌甚至乳酸菌也會在某種程度上引起飼料的腐敗變質［4］。

人們嘗試過很多方法，試圖防止青貯飼料的腐敗變質，延長飼料保存時間。例如，Kung等［5］曾使用丙酸作為添加劑以提高青貯玉米的有氧穩定性。張濤等［6］在苜蓿裹包青貯中，通過添加青貯菌劑來提高青貯產物中乙酸含量，抑制酵母菌和霉菌數量，有助于提高青貯產物的有氧穩定性。傅彤［7］使用有機酸（乙酸和丙酸）有效提高了青貯玉米的有氧穩定性。另外，山梨酸作為一種防腐劑，也能夠抑制酵母菌和霉菌的生長。Wyss等［8］發現添加2g／kg山梨酸鉀于黑麥草（Loliumperenne）青貯中，提高了青貯飼料的有氧穩定性。自從1996年Muck［9］首次證明，布氏乳桿菌（Lactobacillusbuchneri）可以提高青貯飼料的有氧穩定性以來，很多學者對此展開了研究。以下就布氏乳桿菌對青貯發酵、青貯質量、動物生產性能，特別是其對青貯飼料的有氧穩定性方面的影響進行詳細闡述。

1 布氏乳桿菌對青貯發酵的影響

1995年以前，人們一直認為布氏乳桿菌對青貯飼料品質的作用微不足道。然而，這一看法很快被眾多學者推翻，據Beck［10］報道，保存良好的青貯飼料中，植物乳桿菌和彎曲乳桿菌僅在發酵的前4d占主導地位，之后布氏乳桿菌和短乳桿菌逐漸取代它們，成為主導菌群。另外，Garzia和Giovanna［11］在23個青貯樣本中分離出40株乳酸菌和球菌，其中33株屬于異型發酵，而且數目最多的依次是布氏乳桿菌、短乳桿菌和植物乳桿菌。Bucher［12］發現了類似的結果，他從青貯飼料中分離出2 124株乳酸菌，其中707株是布氏乳桿菌。以上結果說明，布氏乳桿菌在飼料發酵過程中起著非常重要的作用，至少在發酵后期是主導菌群。

傳統意義上的青貯接種劑，即同型發酵乳酸菌，通過增加乳酸的生成量以及乳乙酸生成比例，使青貯飼料的pH值迅速下降［13－16］。布氏乳桿菌屬于異型發酵乳酸菌，它對青貯飼料發酵的影響主要是降低乳酸的含量，增加乙酸的生成量，最終使青貯飼料的pH值相對較高。Kung和Stokes［17］發現，當青貯飼料中乳乙酸的生成比例大于3時，一般是同型發酵乳酸菌占主導地位。Ward［18］也發現了同樣的結果。然而，布氏乳桿菌卻不符合這一標準。Kleinschmit和Kung［19］在小粒谷物青貯時，添加2種劑量的布氏乳桿菌（分別是LB1≤105cfu／g，LB2＞105cfu／g），結果表明，對照組的乳乙酸生成比例是5.3∶1.0，而LB1組顯著降低到0.8∶1.0，LB2組則更低，下降到0.6∶1.0。Driehuis等［20］也有類似的研究結果，用L.buchneri40788處理飼料，結果降低了乳乙酸的生成比例，而且部分青貯飼料中乙酸含量甚至超過了乳酸含量。

1.1 布氏乳桿菌對青貯飼料有氧穩定性的影響

青貯飼料暴露于空氣中會腐敗變質，酵母菌被認為是引起飼料變質的元兇，它能夠利用乳酸發酵，引起青貯飼料的pH值升高，從而引起條件性細菌和真菌的生長繁殖，進一步加劇飼料腐敗［21］。青貯飼料在青貯窖或飼槽中保持新鮮（不變質）的能力通常用有氧穩定性表示。有氧穩定性是指青貯飼料暴露于空氣中，飼料溫度高于環境溫度2℃所需要的時間。關于布氏乳桿菌，很多學者研究了它與各種青貯飼料有氧穩定性的關系，包括玉米（Zeamays）［22－25］、禾本科牧草［20］、苜蓿（Medicagosativa）［26］、整株小麥（Triticumaestivum）［27］、整株大麥（Hordeumvulgare）［28，29］、高水分玉米［30，31］、高粱（Sorghumvulgare）［27］和王草（Pennisetumpurpureum×P.typhoideum）［32］。這些研究結果表明，布氏乳桿菌可以明顯改善青貯飼料的有氧穩定性。盡管其對有氧穩定性的提高程度不盡相同，從一天到數周不等，但所表現的積極效應是穩定的。另外，雖然有些研究結果中，布氏乳桿菌沒有明顯改善青貯飼料的有氧穩定性，但是當處理后的青貯飼料與其他飼料混合后，全混合日糧的有氧穩定性卻顯著提高［26，31］。

乙酸是很好的抗真菌物質，其含量的增加能夠抑制青貯飼料中酵母的生長繁殖［33］。Kleinschmit和Kung［19］將布氏乳桿菌添加到青貯玉米和青貯小谷物中，結果發現，布氏乳桿菌處理后青貯玉米中的酵母菌數量僅為處理組的1／10，而且隨著布氏乳桿菌添加劑量的增加，青貯玉米中酵母菌的數量顯著降低。但是，需要注意的是，小谷物青貯未添加布氏乳桿菌組的酵母菌數量也很低，所以小谷物青貯對照組的有氧穩定性相對較高。布氏乳桿菌作為添加劑提高青貯飼料的有氧穩定性是通過抑制環境中酵母菌的生長而實現的。完全理想的情況下，青貯玉米和青貯小谷物的有氧穩定性都要高于飼料飼喂前可能暴露于空氣中的時間（12～24h）。然而，自然條件下，飼喂前和飼喂過程中，空氣總是能夠通過各種途徑滲透進青貯飼料中，如容器裂縫、每次取樣時打開青貯窖、青貯料與青貯窖之間的縫隙等，因此，更應該注重有氧穩定性的相對值。

近幾年有人發現，布氏乳桿菌能夠產生細菌素或類細菌素，這些物質可能也有助于提高青貯飼料的有氧穩定性。細菌素是細菌在代謝過程中，通過核糖體合成機制產生的一類具有生物活性的蛋白質、多肽或前體多肽；這些物質可以殺滅或抑制與之相同或相似生境的其他微生物，如細菌素（Buchnericin，LB）只對革蘭氏陽性菌有抑制作用，對革蘭氏陰性菌則無抑制作用［34］。類細菌素是指不符合或不完全符合細菌素定義的蛋白類拮抗物質，它不僅能抑制革蘭氏陽性菌，而且對革蘭氏陰性菌和真菌也有抑制作用。常峰等［35］研究發現，布氏乳桿菌CF10所產類細菌素Lactobacillin FC－10在酸性條件下穩定且活性高，對革蘭氏陰性菌、酵母菌和真菌有明顯的抑制作用。貢漢生等［36］從乳制品中篩選得到一株產類細菌素的布氏乳桿菌KLDS1.0364，經試驗發現，KLDS1.0364產生的類細菌素的作用方式是殺菌，且抑菌譜廣，并可抑制多種革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌。迄今為止，布氏乳桿菌產生的細菌素和類細菌素都只是處于理論研究階段，并沒有真正作為添加劑使用。

布氏乳桿菌將乳酸降解成乙酸的過程中，同時伴有丙二醇的生成［37］。丙二醇的含量通常占干物質含量的2%～4%［20，38－40］，它能夠通過某些有機物被轉化成丙酸，但是布氏乳桿菌卻沒有這種功能［22］。Krooneman等［41］從青貯飼料中分離出一株乳酸菌Lactobacillusdiolivorans，含有二醇脫激酶因子，能夠將丙二醇降解生成等當量的1－丙醇和丙酸，而丙酸是大家公認的抗真菌物質。然而，并不是所有的青貯飼料中都有同樣的情況發生，例如，Driehuis等［20］在干物質含量為23%的青貯黑麥草中檢測到了較多的1－丙醇和丙酸，但是當黑麥草干物質含量為35%時，并沒有這些發酵產物的生成，相反地，卻檢測到大量的丙二醇。Kleinschmit和Kung［19］的研究發現，布氏乳桿菌對青貯玉米中丙酸的含量并無影響，但是卻增加了青貯小谷物和青貯牧草中丙酸的含量。由此顯示，不同作物將丙二醇轉化成丙酸的能力不同。

1.2 布氏乳桿菌對青貯飼料中乙醇和可溶性碳水化合物含量的影響

布氏乳桿菌對不同作物青貯后乙醇含量和可溶性碳水化合物的含量也有不同的影響。如Kung等［26］的結果顯示，布氏乳桿菌處理組青貯苜蓿的乙醇含量與對照組相比顯著增加，Kleinschmit和Kung［19］用布氏乳桿菌處理后，青貯小谷物飼料中的乙醇含量和碳水化合物的含量都有所增加，但是青貯玉米中二者的含量變化卻不顯著。分析其原因，可能有二。首先，或許布氏乳桿菌能夠增加青貯玉米中乙醇的生成量，但是，其增加的量遠不及青貯玉米本身所含的酵母菌生成的乙醇的量，所以，結果表現為差異不顯著；其次，有研究表明［37］，布氏乳桿菌在pH 3.8（約等于青貯玉米的pH值）時比pH 4.3（約等于小谷物青貯的pH值）時更容易利用碳水化合物進行異型發酵，這樣必然會降低青貯小谷物中碳水化合物的含量，而增加乙醇的生成量。

2 布氏乳桿菌對干物質回收率和動物采食量的影響

目前人們已經肯定并接受了布氏乳桿菌對于青貯飼料有氧穩定性的積極作用，但是仍然有學者認為其造成了干物質的損失［42］，而且使用布氏乳桿菌后，青貯飼料中產生的高劑量乙酸會影響飼料的適口性，降低動物的采食量，進而影響動物的生產性能［43］。很多學者做了相關的研究，結果表明，用布氏乳桿菌處理過的青貯飼料飼喂奶牛［20，31］和綿羊［25］，動物的干物質采食量并沒有受到影響。Kung等［26］的研究表明，布氏乳桿菌不僅沒有限制動物的采食量，而且增加了產奶量。

同型發酵乳酸菌在飼料青貯過程中會造成2%～6%的干物質損失，能量損失則更少；而異型發酵過程中，因為有二氧化碳的生成，干物質損失相對較高，5%～24%不等，能量損失則通常低于2%。Weinberg等［44］測定了不同處理間（植物乳桿菌組、布氏乳桿菌組以及二者聯合應用組）二氧化碳的生成量，結果顯示，青貯全株小麥中，植物乳桿菌組的二氧化碳含量高于其他各組。這可能是因為植物乳桿菌組相對較多的酵母和霉菌產生二氧化碳的結果。然而，布氏乳桿菌組很好地抑制了這些有害菌的生長繁殖，所以生成的二氧化碳的總量顯著少于植物乳桿菌組。Kleinschmit和Kung［19］的試驗結果顯示，布氏乳桿菌處理組青貯玉米的干物質損失比對照組高1.0%，而處理組青貯小谷物的干物質損失比對照組大約高1.5%。1.0%～1.5%的干物質損失與飼料腐敗變質引起的損失相比是微不足道的。這些結果表明，布氏乳桿菌造成的干物質損失是可以忽略的，而且能夠有效提高青貯飼料的有氧穩定性，對制作優質青貯具有重要意義［45］。

3 布氏乳桿菌使用效果分析

布氏乳桿菌對于青貯飼料的影響與青貯原料和添加劑量有很大關系。Kleinschmit和Kung［19］報道，布氏乳桿菌添加量大于105cfu／g時，接種劑對玉米青貯的效果要好于禾本科牧草和小顆粒谷物飼料；而且隨著添加量的增加，3種青貯飼料的有氧穩定性都逐步提高。Ranjit和Kung［24］發現，當布氏乳桿菌的接種量為106cfu／g時，青貯飼料的有氧穩定性顯著高于苯甲酸鹽和丙酸添加劑的效果。然而，當接種量為105cfu／g時，其效果要低于苯甲酸鹽和丙酸。另外，Kung和Ranjit［29］證明，如果添加量小于5×105cfu／g，那么布氏乳桿菌不能顯著提高青貯飼料的有氧穩定性。這可能是因為，布氏乳桿菌的添加劑量不足以使其成為青貯飼料的主導菌群。

Schmidt等［46］分別用布氏乳桿菌和植物乳桿菌處理飼料，測定了發酵第240天青貯飼料中乳酸菌的數量。結果發現，乳酸菌的數量隨著植物乳桿菌添加量的增加而顯著增加，但是當布氏乳桿菌的接種量增加時，并沒有出現相同的結果，這說明發酵第240天，布氏乳桿菌成為飼料中的主導菌群。Schmidt等［46］和Mari等［47］同樣發現，布氏乳桿菌處理的青貯玉米與對照組相比，乳酸菌的數量顯著增加，而且通過實時定量PCR（聚合酶鏈反應）方法測定可以發現處理組中布氏乳桿菌的數量顯著增加。

目前，很多學者研究了布氏乳桿菌與酶聯合應用效果。例如，Taylor和Kung［48］在高水分玉米青貯中同時添加布氏乳桿菌和酶，結果青貯飼料的有氧穩定性顯著提高。然而，Ebling［49］的試驗結果與之不一致，因為β－葡聚糖酶、α－淀粉酶、木聚糖酶和半乳甘露糖酶與布氏乳桿菌聯合應用并沒有提高青貯玉米的有氧穩定性。除此之外，布氏乳桿菌與同型發酵乳酸菌的聯合使用也是近期研究的熱點。Weinberg等［44］為檢驗植物乳桿菌和布氏乳桿菌對全株小麥和玉米青貯的影響，將試驗分為4組，即A（對照組，不添加微生物接種劑），B（只添加植物乳桿菌組）、C（只添加布氏乳桿菌組）以及D（布氏乳桿菌和植物乳桿菌聯合應用組）。青貯3個月后，D組青貯小麥的乙酸含量最高，而且沒有霉菌生長；而對照組和B組的青貯飼料表層有霉菌生長。但是青貯玉米中，C組即只添加布氏乳桿菌組，飼料表層有霉菌生長，但是與對照組相比，有氧穩定性仍然較高，酵母菌數量較少，二氧化碳的生成量也相對較少。

4 布氏乳桿菌的前景展望

以前的研究中，布氏乳桿菌的計數通常采用傳統的MRS（de Man，Rogosa，and Sharpe agar）培養基進行平板計數，但這種方法有很大的局限性，因為在MRS培養基上所有的乳酸菌都能夠生長，所以無法準確統計布氏乳桿菌和其他乳酸菌的數量，從而給研究工作帶來很多不便。近幾年興起的實時定量PCR方法能夠很好的解決這一問題，Schmidt等［46］采用這種方法發現青貯過程中，布氏乳桿菌和植物乳桿菌的消長關系，并且通過對布氏乳桿菌的準確計數發現，直到青貯后期布氏乳桿菌才成為主導菌群。所以，實時定量PCR方法值得在青貯研究過程中推廣并使用。

另外，隨著人們對布氏乳桿菌作用的認可，越來越多的生產者開始使用這種微生物添加劑，但是其作用機理仍然不是很明確，特別是近年來發現有些布氏乳桿菌能夠產生類細菌素，它們能夠有效地抑制革蘭氏陰性菌和真菌，但目前僅限于理論研究階段，如果將這些類細菌素開發成添加劑直接應用在生產中，相信意義更為深遠。

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