林蛙油對大鼠肝纖維化的影響

李 艷 扈昕虹 郭素紅 袁忠海 侯毅鞠 郝 峰 張 磊 許會靜 李正袆

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

林蛙油(又稱為蛤蟆油，田雞油，哈什螞油)為雌性林蛙輸卵管的干制品，含有多種蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、脂溶性維生素、微量元素、固醇類化合物、雌激素等含量甚高，具有提高機體的抗氧化能力，降血脂、抗衰老，防治腫瘤、增強機體免疫功能等作用〔1〕，但其活性成分對肝纖維化的影響及機制不十分清晰。本研究旨在探討林蛙油對肝纖維化形成的影響及抗肝纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1 動物 選擇230～280 g、成年雄性Wistar大鼠100只，清潔級，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部動物實驗中心提供。基礎(chǔ)飼料由吉林醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心配制。

1.2 藥品及試劑 林蛙油:購買長白山林蛙干油，由本校藥學(xué)院雷均濤教授鑒定為真品。1 g林蛙油加蒸餾水30 ml，浸泡10 h。林蛙油泡好后，顏色雪白，膨大，略帶腥味，松軟而有彈性;用勻漿機制成勻漿液，冷凍保存，大鼠灌胃。給藥量按動物體表面積計算，高劑量0.3 g/100 g體重大鼠，低劑量0.15 g/100 g體重大鼠。一氧化氮(NO)檢測試劑盒、羥脯氨酸(Hyp)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒、丙二醛(MAD)測定試劑盒、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)均購于中生北控生物科技股份有限公司，用全自動生化分析儀測定;秋水仙堿、四氯化碳(CCl4)、橄欖油為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 分組 Wistar大鼠85只，隨機分為7組，其中正常組10只，橄欖油對照組12只，肝硬化模型組15只，秋水仙堿組12只，林蛙油低劑量組13只，高劑量組12只及肝硬化自然恢復(fù)組11只。

1.4 模型的復(fù)制 正常組大鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.2 ml/100 g，2次/w;橄欖油對照組大鼠腹腔內(nèi)注射橄欖油，2 ml/kg，2次/w;CCl4模型組大鼠腹腔內(nèi)注射體積分數(shù)為0.40的CCl4(溶于橄欖油中，除菌過濾)，首次給藥0.3 ml/100 g，以后0.2 ml/100 g，2次/w。從第9周起，從大鼠尾靜脈采血進行肝功能項目檢查，測定ALT、AST、ALP、GGT及總膽紅素，結(jié)果模型組較對照組明顯升高，血清白蛋白水平則明顯下降(P＜0.05)，各組處死2只，病理組織學(xué)證實造模組大鼠有典型的纖維間隔增寬，形成肝纖維化。10 w末大鼠停止造模(其后每周注謝1次40%CCl4，防止自然恢復(fù))，并開始給予藥物干預(yù)，造模后從CCl4組大鼠再分為肝纖維化模型組、林蛙油低劑量組、高劑量組、秋水仙堿組、自然恢復(fù)組。自然恢復(fù)組不作任何處置，任其自然恢復(fù)。秋水仙堿組按0.1 mg·kg-1·d-1(配制成0.01%濃度后按1 ml·kg-1·d-1)腹腔注射，2次/w，連續(xù)8 w。各組大鼠每周稱量體重1次，根據(jù)體重變化情況調(diào)整給藥劑量以及觀察每組動物體重變化有無差異、進食量、毛色等情況，初步估計肝功能有無衰竭的可能，以降低造模造成的死亡率。實驗大鼠均在18 w末處死，于末次灌胃24 h后，20%烏拉坦腹腔麻醉，肝素抗凝，腹主動脈取血，離心，分離血清待測。大鼠肝臟冷鹽水快速灌注，提取，稱重，并做10%肝臟組織勻漿，待測Hyp。實驗中有15只大鼠死亡未列入統(tǒng)計。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 計量資料用統(tǒng)計軟件SPSS11.5進行方差分析及非參數(shù)檢驗。實驗數(shù)據(jù)用±s表示。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 在實驗過程中，空白對照組大鼠營養(yǎng)狀況良好，體重自然增加，行動敏捷，食欲正常，皮毛密集而有光澤。肝硬化模型組大鼠腹部膨隆，精神萎靡，倦臥少動，易激惹，皮毛干澀，個別大鼠趾甲易出血，大鼠頭頸背部、眼眶周圍及前肢出現(xiàn)輕度脫毛，脫毛處皮膚顏色、質(zhì)地未見異常，蓬松少華，食欲欠佳，體重增長緩慢或不增長，死亡率高。林蛙油用藥組大鼠精神、毛色及進食量均好于肝硬化模型組。實驗過程中模型組大鼠死亡9只，秋水仙堿組和林蛙油高劑量組各死亡3只。死亡原因經(jīng)解剖分析均為CCl4中毒及灌注損傷死亡。

2.2 大鼠肝功能實驗室檢查 ALT、AST、ALP、GGT的含量均有明顯升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);林蛙油治療的低、高劑量組血清ALT、AST、ALP、GGT含量均低于模型組，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

2.3 肉眼觀察 正常對照組大鼠肝臟外觀紅潤，表面光滑，質(zhì)地較軟;肝纖維化模型組大鼠肝臟呈黃褐色，表面粗糙，部分見較多細小結(jié)節(jié)，質(zhì)地較脆。治療各組大鼠肝臟呈褐色，表面粗糙，部分可見細小結(jié)節(jié)，質(zhì)地偏硬。

2.4 林蛙油對肝纖維化大鼠抗氧化能力的影響 見表2。

2.5 大鼠體重、肝濕重及肝指數(shù)變化 肝指數(shù)=肝濕重/末次體重×100%。見表3。

表1 肝纖維化大鼠肝功能實驗(±s)

表1 肝纖維化大鼠肝功能實驗(±s)

與空白對照組比較:1)P＜0.01，與模型組比較:2)P＜0.01，與秋水仙堿組比較:3)P＜0.01，與林蛙油組:4)P＜0.01。下表同

分組 n ALT(U/L) AST(U/L) ALP(U/L) GGT(U/L) Hyp(μg/ml)空白對照組10 43±17 124±21 71±25 2.4±0.9 5.5±1.4橄欖油組 12 46±21 117±27 83±30 2.1±1.1 5.2±0.8林蛙油低劑量 13 181±802) 372±2142) 205±1122) 2.6±1.42) 7.7±1.52)林蛙油高劑量 12 156±652)3) 323±1812)3) 172±942)3) 2.2±0.92)3) 6.3±2.22)3)秋水仙堿組 10 214±912) 405±2262) 249±1312) 2.7±1.42) 8.5±2.92)自然恢復(fù)組 11 336±1084) 617±3054) 423±1814) 3.1±1.74) 10.7±3.44)模型組 12 348±1171) 683±2731) 511±1721) 3.9±2.01) 11.1±0.71)

表2 肝纖維化大鼠抗氧化能力的測定(±s)

表2 肝纖維化大鼠抗氧化能力的測定(±s)

分組 n NO(μmol/L) SOD(U/ml)GSH-Px(U)MDA(nmol/ml)空白對照組10 20.5±18.2 169±26 678±71 5.1±1.1橄欖油組 12 24.1±13.4 154±24 621±74 5.9±1.6林蛙油低劑量13 46.8±11.22)3)103±312)3) 482±602)3) 8.6±2.32)3)林蛙油高劑量12 33.1±12.32)3)136±372)3) 524±892)3) 6.4±1.72)3)秋水仙堿組 10 50.3±23.52) 121±412) 473±832) 8.2±2.42)自然恢復(fù)組 11 68.6±21.74) 71±234) 396±754) 10.5±3.24)模型組 12 70.2±27.11) 67±171) 359±821) 11.3±2.81)

表3 大鼠體重、肝濕重及肝指數(shù)變化(±s)

表3 大鼠體重、肝濕重及肝指數(shù)變化(±s)

分組 n 體重(g) 肝濕重(g) 肝指數(shù)(%)正常組10 387±29 10.93±1.4 2.82±0.7橄欖油組 12 382±32 11.45±2.9 3.00±0.3林蛙油低劑量組 13 275±332)3)10.66±1.72)3)3.88±0.92)3)林蛙油高劑量組 12 293±222)3)10.22±2.42)3)3.49±1.42)3)秋水仙堿組 10 262±272) 11.04±3.02) 4.22±2.42)自然恢復(fù)組 11 251±244) 11.25±2.74) 4.48±1.64)模型組 12 236±331) 12.47±3.31) 5.28±2.31)

3 討論

肝纖維化是一個可逆的過程，將病變終止于肝纖維化階段，對于慢性肝病的防治具有重要作用。近年來我國致力于中醫(yī)中藥抗肝纖維化的研究，消除病因、阻斷和抑制肝纖維化的進程是目前防治肝硬化的主要手段〔2，3〕。

本實驗采用CCl4皮下注射的方法制備肝纖維化模型，以觀察林蛙油對肝纖維化的療效并探討其發(fā)生機制。本文結(jié)果提示林蛙油可以顯著降低CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT的水平，較秋水仙堿藥物對照組效果明顯，說明林蛙油具有保護肝臟、改善肝功能作用;Hyp是膠原蛋白特有的氨基酸，是膠原代謝的重要產(chǎn)物，在肝纖維化時膠原蛋白合成增多，其在肝臟中的含量可反映膠原代謝的變化情況，與肝纖維化程度相平行，是評估膠原蛋白含量和肝纖維化程度的直接指標，本實驗結(jié)果說明肝纖維化時膠原合成十分活躍，林蛙油組能使升高的Hyp降低，減少膠原蛋白的產(chǎn)生，并好于秋水仙堿組，表明林蛙油對大鼠肝纖維化程度具有較好的逆轉(zhuǎn)作用。

體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)如SOD、GSH-Px是體內(nèi)清除自由基的關(guān)鍵酶，可清除自由基，抑制自由基啟動的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，防御自由基對機體組織的損傷。MDA為脂質(zhì)過氧化物的終產(chǎn)物，它使蛋白質(zhì)核酸脂類發(fā)生交聯(lián)，使生物膜變性，細胞突變衰老和死亡。NO是一種很活躍的自由基，近年來研究發(fā)現(xiàn)ON及一氧化氮合成酶(NOS)在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中起著重要作用〔4〕，本研究說明肝損傷時產(chǎn)生大量自由基和脂質(zhì)過氧化物，導(dǎo)致二種酶被耗竭，從而使機體抗氧化防御機制受損，不能清除過多的自由基而導(dǎo)致肝臟受損。同時因肝細胞受損清除能力下降，產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物促進肝星狀細胞活化，同時激活各種細胞因子，刺激細胞外基質(zhì)(ECM)的合成，抑制ECM降解，導(dǎo)致肝纖維化〔5～7〕，所以模型組肝臟中Hyp增高。另外，林蛙油高劑量組大鼠血清SOD、GSH-Px活性較模型對照組顯著升高，MDA含量則明顯降低，表明林蛙油有降低自由基生成、減輕脂質(zhì)過氧化的作用，能夠拮抗CCl4的毒性作用，保護肝細胞，減輕肝損傷，加速清除自由基，防止其對肝細胞膜中不飽和脂肪酸的破壞，延緩細胞膜的老化和損傷，改善肝功能，這可能是抗脂質(zhì)過氧化的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)肝硬化模型組大鼠血清NO明顯升高，NO水平升高與實驗性大鼠肝臟的損害的程度成正比，過量的NO有促進肝損傷的作用，也具有抑制肝細胞蛋白合成的作用。肝硬化時，腸道內(nèi)毒素的生成和攝取增多，肝臟對內(nèi)毒素清除功能減退，使內(nèi)毒素進入體循環(huán)并發(fā)生內(nèi)毒素血癥，內(nèi)毒素血癥又可直接和(或)間接通過激活巨噬細胞、枯否細胞釋放、腫瘤壞死因子(TNF)等來誘導(dǎo)產(chǎn)生大量NO，造成NO水平升高，NO的合成和分泌增加，導(dǎo)致血管擴張，部分組織血流量增加，肝內(nèi)血流分布不均，最終導(dǎo)致門脈血流動力學(xué)紊亂，使肝病的病情加重。因此，檢側(cè)血清NO含量對臨床估計肝硬化的病情進展及療效觀察有一定的價值。但林蛙油高劑量組大鼠血清NO水平下降，提示選擇林蛙油等合適的抑制誘導(dǎo)型NO合酶(iNOS)藥物適當(dāng)?shù)匾种芅O過量產(chǎn)生，可能有助于減輕肝損傷。

1 于 洋，姜大成，張煒煜.哈蟆油對免疫力低下小鼠體內(nèi)脂肪酸含量的影響〔J〕.長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008;24(2):150-1.

2 梁 健，安永輝，鄧 鑫.中醫(yī)藥抗纖維化的研究進展〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志，2009;36(11):2007-9.

3 李文斌，趙紅宇.靈芝孢子粉抗肝纖維化作用的實驗研究〔J〕.中國老年醫(yī)學(xué)雜志，2008;28(6):537-8.

4 趙成艷，馬 榮，何曉琳，等.肝硬化患者血清一氧化氮及一氧化氮合酶檢測的臨床價值〔J〕.中國醫(yī)療前沿，2007;2(7):13-4.

5 張瑞娟，高潤平，楊秀云，等.肝纖維化基因治療的現(xiàn)狀及展望〔J〕.中國老年醫(yī)學(xué)雜志，2008;28(21)，2175-8.

6 張定鳳.抗肝纖維化治療的趨勢〔J〕.中華肝臟雜志，2007;15(10):721-4.

7 劉海林，王 磊.肝纖維化的研究進展〔J〕.國際消化病雜志，2007;27(4):235-6.