氯丙嗪協同欖香烯對Hep-2細胞增殖的抑制作用

夏軼男 劉 敩 蔡 郁 于廣池 (吉林大學第二醫院，吉林 長春 3004)

化療增敏劑通過逆轉腫瘤組織耐藥，干擾腫瘤細胞與組織微環境間耐藥信號傳導等提高化療效果。近年來，國內外學者應用辛可寧、瑞米酚、酚塞嗪等藥物作為化療增敏劑，聯合化療藥物應用，提高臨床治療效果〔1，2〕。本研究觀察鹽酸氯丙嗪聯合欖香烯制劑對人喉癌細胞株Hep-2細胞的增殖抑制率、細胞周期進程和凋亡率的影響，為喉癌化療增敏劑的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑 Hep-2細胞株由吉林省腫瘤研究所惠贈，欖香烯乳注射液(大連金港制藥有限公司生產);噻唑藍(MTT)試劑，RPMⅠ1640培養基(Sigma公司);胎牛血清(長春生物制品研究所)。

1.2 方法

1.2.1 MTT比色法 單純欖香烯組取對數生長期的Hep-2細胞，調細胞數為2×105/ml，接種于96孔塑料培養板內，每孔100 μl，靜止培養 12 h后每孔內分別加入25、50、100 μg/ml欖香烯制劑，每個濃度10復孔，靜止培養24 h，于結束前6 h，每孔內分別加入MTT試劑20μl/孔，終濃度為50 mg/L，繼續培養6 h后，吸棄上清，加入二甲基亞砜150μl/孔，振蕩10 min，使MTT還原產物完全溶解，于酶標儀570 nm處測量各孔吸光度A值，按下列公式計算不同濃度欖香烯制劑對Hep-2細胞增殖抑制率的影響。

Hep-2細胞抑制率=(1-加藥孔細胞A值÷對照孔細胞A值)×100%

1.2.2 聯合組 根據預實驗結果，取欖香烯50μg/ml加入鹽酸氯丙嗪4 mg/ml，實驗條件同1.2.1。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期進程及凋亡率 細胞培養及分組同1.2.1，不同之處是將96孔塑料培養板改為25 ml培養瓶，培養結束后，分別收集經不同條件作用后的Hep-2細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，離心棄上清，細胞經70%冷乙醇固定，4℃保存，上機前過40目網，調細胞數為1×106/ml，碘化丙啶(PⅠ)染色，流式細胞儀檢測。

1.3 統計學方法 應用SPSS11.0軟件，計量數據以±s表示，細胞增殖抑制率組間比較采用t檢驗，細胞周期組間比較采用F檢驗。

2 結果

2.1 Hep-2細胞增殖抑制率 MTT結果顯示單純欖香烯組(25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml)Hep-2 細胞增殖抑制率分別為14.0%、23.9%和28.6%，與對照組相比差異顯著;而聯合組，即50μg/ml欖香烯與4 mg/ml氯丙嗪組對Hep-2細胞增殖抑制率為39.2%，抑制效果優于100μl/ml欖香烯組，具有良好的增敏作用。

2.2 Hep-2細胞周期進程及凋亡率 流式細胞儀結果顯示單純欖香烯組隨著欖香烯濃度的增加，G0/G1期細胞增多，S期細胞減少，而G2/M期細胞相對增多，細胞凋亡率升高;而聯合組即50μg/ml欖香烯與4 mg/ml氯丙嗪組效果更為明顯。見表1，表 2。

表1 不同濃度欖香烯制劑對Hep-2細胞周期進程及凋亡的影響(±s，%/24 h)

表1 不同濃度欖香烯制劑對Hep-2細胞周期進程及凋亡的影響(±s，%/24 h)

與0μg/ml組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 G0/G1 S G2/M 凋亡率(%)0 μg/ml組29.4±2.1 61.2±4.7 8.7±1.5 0.3 25μg/ml組 45.8±4.41)38.1±4.12)16.1±2.91) 7.62)50μg/ml組 53.3±3.62)27.8±4.72)18.8±3.22) 12.62)100μg/ml組 62.2±5.12)15.9±2.22)21.5±3.62) 17.32)

表2 單純欖香烯組與聯合組對Hep-2細胞周期進程及細胞凋亡率的影響(±s，%/24 h)

表2 單純欖香烯組與聯合組對Hep-2細胞周期進程及細胞凋亡率的影響(±s，%/24 h)

與欖香烯組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 G0/G1 S G2/M 凋亡率(%)欖香烯組53.3±3.6 27.8±4.7 18.8±3.2 12.6聯合組 68.6±5.41) 9.5±2.12) 21.5±2.61) 17.32)

3 討論

化療增敏劑是指沒有抗腫瘤作用，但能提高已知有抗腫瘤作用藥物的化療效果，增強抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的殺傷或降低其對正常組織細胞毒性的一類藥物〔3〕。本研究應用MTT比色法觀察欖香烯聯合氯丙嗪對Hep-2細胞的增殖抑制作用。欖香烯是國家二類非細胞毒性抗腫瘤新藥，動物實驗及臨床證明對多種腫瘤細胞有明顯的抑制作用〔4〕;且毒副作用小，抗腫瘤譜廣，價格低廉，具有廣闊應用前景。氯丙嗪屬于酚噻嗪類化合物，是鈣調蛋白抑制劑，與化療藥物合用后顯著改變化療藥物的藥代動力學機制〔5〕。MTT結果顯示，不同濃度的欖香烯制劑對Hep-2細胞增殖抑制率均有影響，與對照組相比差異顯著，尤其在50μg/ml欖香烯組增加4 mg/ml鹽酸氯丙嗪后，極大提高了對Hep-2細胞的增殖抑制效果，抑制率由23.9%升高至39.2%。因為MTT試劑可被哺乳動物活細胞線粒體中的脫氫酶還原成藍色的甲臜顆粒，且甲臜生成的量與活細胞數目及細胞活化狀態呈線性關系。所以，該方法被廣泛用于抗腫瘤藥物的篩選和細胞毒性實驗研究的客觀指標。

本研究還應用流式細胞儀檢測不同濃度的欖香烯對Hep-2細胞周期進程的影響，結果表明，欖香烯能夠抑制Hep-2細胞G1期向S期細胞轉化進程，從而使G1期細胞增多，S期細胞減少，造成G2/M期細胞相對增多，而G2/M期細胞增多是細胞損傷的普遍反應，這一點從細胞凋亡率上得到體現。G1期細胞是指細胞從有絲分裂到DNA復制之前，G1期是制造和產生mRNA、rRNA、tRNA及核蛋白體的階段，而且G1期也是藥物作用的敏感點〔6〕。因此，抑制G1期的RNA合成，可間接地使腫瘤細胞合成減少。本實驗結果顯示，欖香烯聯合氯丙嗪能顯著抑制G1期向S期轉化，造成G1期細胞堆積，不能進入S期，從而使細胞增殖變緩，達到抑制腫瘤增殖的目的。

1 王 濤，徐 軍，鐘南山.肺癌多藥耐藥生物逆轉策略〔J〕.國外醫學:腫瘤學分冊，2002;29(5):378-80.

2 Sehn LZ，Hua YB，Yu XM，et al.Tamoxifen can reverse multidrug resistance of colorectal carcinoma in vivo〔J〕.World J Gastroenterol，2005;11(7):1060-4.

3 張志紅，宋朝暉.腫瘤化療增敏劑研究進展〔J〕.國際腫瘤學雜志，2006;33(7):506-8.

4 周洪語，侯菊生，王 勇，等.欖香烯誘導神經膠質瘤細胞凋亡的劑量和時間依賴性研究〔J〕.中華腫瘤雜志，2006;28(4):270-1.

5 Okumieff P，Meyn RE，Teicher B，et al.Report from the radiation oncology committee of the southwest oncology group(SWOG):Research objectives workshop，2003〔J〕.Am JClin Oncol，2003;26(5):522-5.

6 Shao J，Lee SB，Guo H，et al.Prostaglandin E2 stimulates the growth of colon cancer cells via induction of amphiregulin〔J〕.Cancer Res，2003;63(17):5218-23.