高壓氧預處理對缺血-再灌注誘導的糖尿病大鼠心功能的影響

谷莉娜 鄭 楊 谷鐵軍 王奭驥 (吉林大學第一醫院，吉林 長春 3002)

再灌注是目前治療急性心肌梗死(AMⅠ)最有效的措施，但同時帶來的再灌注損傷可加速心肌細胞凋亡壞死，導致心梗面積擴大、心律失常和心功能惡化。減少再灌注損傷可大大改善AMⅠ病人的預后。本研究旨在探討高壓氧預處理對缺血-再灌注誘導的糖尿病大鼠心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 30只健康成年雄性Wistar大鼠，體重250～350 g，由吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心提供。

1.2 儀器及試劑 動物實驗高壓氧艙(煙臺冰輪高壓氧艙有限公司);BL-420生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司);電子天平ESJ60-4(沈陽龍騰電子有限公司);電子天平HX5CC1(慈溪市天東衡器廠);灌流液濾過裝置(吉林大學基礎醫學院藥理學院);Langerdorff離體灌流裝置(沈陽國藥集團定制);光學顯微鏡BX51(日本OLYPUS公司 );石蠟切片機RM 2245(德國 LEⅠCA公司)。

1.3 方法

1.3.1 造模 30只成年雄性Wistar大鼠，高脂飼料(88.8%基礎飼料、1%膽固醇、10%豬油和0.2%膽鹽)飼養1個月后給予大鼠2%STZ一次性腹腔注射(40 mg/kg)，1 w后取尾血測血糖，以血糖＞16.7 mmol/L為糖尿病模型成功。大鼠繼續常規飼料喂養2個月。

1.3.2 分組及干預 將造模成功的2型糖尿病大鼠隨機分為糖尿病對照組(DM-C組，n=10);以K-H液持續灌流120 min;糖尿病缺血-再灌注組(DM-Ⅰ/R組，n=10)，以K-H液穩定灌流20 min后，停止灌流30 min，再灌注120 min;糖尿病高壓氧預處理組(DM-P組，n=10):先經過高壓氧預處理，其余實驗方法同DM-Ⅰ/R組。高壓氧預處理方法:先洗艙，以保證艙內處于純氧狀態;然后將大鼠放進動物實驗高壓氧艙內，以0.2 ATA/min注入純氧，至壓力達到2.0 ATA(標準大氣壓);當壓力穩定后，將大鼠放置60 min;達到規定后時間后，以0.2 ATA/min排放艙內氧氣，至艙內壓力恢復至正常，1次/d，共7 d。

1.3.3 離體大鼠心臟灌流(Langendorff)模型 Langendorff模型是在恒溫恒壓條件下，從主動脈根部用氧飽和的K-H灌流液逆向灌流，因逆向灌注關閉了主動脈瓣，類似于在體心臟處于舒張期，停止灌流即模擬全心缺血狀態，恢復灌流即全心再灌注開始。具體步驟:取大鼠，秤體重，按5 ml/kg給予20%烏拉坦腹腔注射麻醉后，置于動物臺上，固定四肢。迅速開胸取出心臟并立即置于4℃ K-H緩沖液中，輕輕擠壓心室，使心腔中殘余血排除。開啟Langendorff灌流裝置，流量約10 ml/min;于液面下在1 min內迅速把主動脈接于灌流的套管上，將大鼠心臟懸掛于Langendorff裝置上，并以絲線結扎固定。用95%O2、5%CO2平衡的37℃ K-H液行主動脈逆行恒壓灌流，灌流壓力為80 cmH2O。剪去左心耳，將帶有水囊的壓力換能器(事先應排盡空氣)通過左心房插入左心室。壓力換能器的另一端接于BL-420生物機能實驗系統，由其來記錄血流動力學變化及室性心律失常發生率。

1.3.4 心肌梗死面積測定 灌流畢，速取心臟，冰冷生理鹽水沖洗后剪去心房及右心室，20℃ 10 min。將左心室自心尖向左心底部橫切成相等的1～2 mm厚度的數片，放棄心尖和心底部分，以朝向心尖部的切面作為面積分析切面。將心肌切片放入pH7.4，1%TTC磷酸鹽緩沖液中，濃度為0.2 mol/L，38℃孵育20 min。冷生理鹽水洗去殘余染料，非梗死心肌呈紅色，梗死心肌不著色，10%甲醛固定24 h。各標本采用固定焦距的數碼相機照相。應用德國Ⅰmgage tool圖像分析系統計算梗死面積。面積測定方法:以壞死面積之和占總面積的百分比為心肌梗死面積。

1.4 統計學處理 采用SPSS11.5統計軟件，計量資料以±s表示，兩組間數據比較用t檢驗。

2 結果

2.1 血流動力學指標 DM-C組與其他兩組離體大鼠心臟平衡期血流動力學指標無明顯差異(P＞0.05)。全心灌流120 min內血流動力學無明顯變化;DM-Ⅰ/R組缺血30 min，再灌注 10、30、60、120 min 時 LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均明顯降低(P＜0.01);DM-P組在各時間點LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax下降幅度＜DM-Ⅰ/R組(P＜0.05)。見表1。

表1 高壓氧預處理對糖尿病大鼠離體心臟LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的影響(±s，n=10)

表1 高壓氧預處理對糖尿病大鼠離體心臟LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的影響(±s，n=10)

與DM-C組比較:1)P＜0.01;與DM-Ⅰ/R組比較:2)P＜0.05

組別 缺血即刻 再灌注后10 min 再灌注后30 min 再灌注后60 min 再灌注后120 min DM-C組 LVSP(mmHg) 84±4.43 83±3.69 76±4.94 77.83±4.62 76.67±6.44+dp/dtmax 2 859.33±227.94 2 918.15±401.12 2 985.33±414.78 2 963.17±435.90 2 920.67±553.51-dp/dtmax 2 847.5±302.63 2 874.5±447.03 2 858.33±414.02 2 853.5±428.10 2 729.67±425.15 DM-Ⅰ/R組 LVSP(mmHg) 84.17±5.31 55.83±3.061) 48±6.031) 42.67±3.721) 38.67±3.271)+dp/dtmax 2 913.17±241.55 1 797±303.621) 1 688.17±389.051) 1 465.67±264.051) 1 298.67±156.931)-dp/dtmax 2 861.17±339.43 1 994±265.741) 1 726.17±81.731) 1 619.5±34.061) 1 296.5±13.031)DM-P組 LVSP(mmHg) 82.5±6.06 61.17±4.442) 55±1.792) 49.83±5.192) 42.5±1.762)+dp/dtmax 2 906.33±469.80 2 132±71.272) 2 044±312) 1 769.17±127.352) 1 466.67±35.562)-dp/dtmax 2 899.67±371.15 2 137.83±163.092) 1 975.33±247.262) 1 721.5±87.852) 1 518.5±25.092)

2.2 再灌注后室性心律失常發生情況 DM-Ⅰ/R組發生室性心律失常(多發室性期前收縮、室性期前收縮呈二聯律或室性心動過速)5例，DM-P組1例，差異有統計學意義(P＜0.01)。

2.3 心肌梗死范圍 DM-Ⅰ/R組心肌梗死范圍為56.05%，DM-P組心肌梗死范圍為40.30%，較DM-Ⅰ/R組明顯減小(P﹤0.05)。見圖1，圖2。

圖1 糖尿病缺血再灌注組

圖2 糖尿病高壓氧預處理組

3 討論

超過1個大氣壓的壓力稱高氣壓。在高氣壓環境中吸入高濃度氧或純氧，使氧壓或氧分壓大于常壓純氧水平的氧，即稱為高壓氧。高壓氧廣泛應用于治療缺血缺氧性疾病。研究表明〔1～4〕，高壓氧預處理可減輕大鼠的心肌缺血-再灌注損傷。但高壓氧預處理對糖尿病大鼠心肌缺血-再灌注損傷的影響至今未見報道。本實驗通過構建糖尿病大鼠Langendorff離體心臟灌流模型，以探討高壓氧預處理對其離體心臟缺血-再灌注損傷后心功能及心肌梗死面積的影響。

本研究顯示，離體糖尿病大鼠給予高壓氧預處理后可顯著改善再灌注后LVSP以及±dp/dtmax等血流動力學指標及室性心律失常的發生;同時高壓氧預處理減少了糖尿病大鼠心肌梗死面積(56.05%vs 40.30%)。考慮到在體實驗過程中存在神經調節和機體整體反射活動的參與，本實驗采用離體大鼠心臟模型，排除神經因素和機體整體反射活動的影響，觀察高壓氧預處理對糖尿病大鼠缺血再灌注心肌的保護作用。實驗結果證實:高壓氧預處理能夠減輕糖尿病大鼠心肌再灌注損傷，表現為心肌梗死面積縮小，再灌注后室性心律失常明顯減少，血流動力學指標改善。

高壓氧可用于防治臟器的缺血再灌注損傷，包括肝臟、心臟、神經系統等，關于高壓氧防治缺血再灌注損傷涉及的機制，Chaves等〔5〕研究表明，高壓氧通過抑制肝細胞的凋亡保護肝臟的缺血再灌注損傷。Yamashita等〔6〕研究表明，高壓氧預處理通過抑制P38蛋白激酶磷酸化發揮神經保護作用，而Li等〔7〕則認為高壓氧預處理是通過抑制線粒體凋亡途徑治療大腦的缺血再灌注損傷。關于高壓氧預處理對糖尿病大鼠缺血再灌注心肌的保護作用的機制，目前國內外尚無報道。本研究表明，高壓氧預處理可抑制糖尿病大鼠心肌細胞的凋亡;但關于高壓氧預處理如何實現其抗細胞凋亡，涉及的信號轉導通路及行高壓氧預處理的最佳療程尚有待進一步研究。

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5 Chaves JC，Fagundes DJ，Sim?es Mde J，et al.Hyperbaric oxygen therapy protects the liver from apoptosis caused by ischemia-reperfusion injury in rats〔J〕.Microsurgery，2009;29(7):578-83.

6 Yamashita S，Hirata T，Mizukami Y，et al.Repeated preconditioning with hyperbaric oxygen induces neuroprotection against forebrain ischemia via suppression of p38 mitogen activated protein kinase〔J〕.Brain Res，2009;1301:171-9.

7 Li JS，Zhang W，Kang ZM，et al.Hyperbaric oxygen preconditioning reduces ischemia-reperfusion injury by inhibition of apoptosis via mitochondrial pathway in rat brain〔J〕.Neuroscience，2009;159(4):1309-15.