高壓氧預(yù)處理對(duì)缺血-再灌注誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心功能的影響

谷莉娜 鄭 楊 谷鐵軍 王奭驥 (吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 3002)

再灌注是目前治療急性心肌梗死(AMⅠ)最有效的措施，但同時(shí)帶來的再灌注損傷可加速心肌細(xì)胞凋亡壞死，導(dǎo)致心梗面積擴(kuò)大、心律失常和心功能惡化。減少再灌注損傷可大大改善AMⅠ病人的預(yù)后。本研究旨在探討高壓氧預(yù)處理對(duì)缺血-再灌注誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 30只健康成年雄性Wistar大鼠，體重250～350 g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 儀器及試劑 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)高壓氧艙(煙臺(tái)冰輪高壓氧艙有限公司);BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);電子天平ESJ60-4(沈陽龍騰電子有限公司);電子天平HX5CC1(慈溪市天東衡器廠);灌流液濾過裝置(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)院);Langerdorff離體灌流裝置(沈陽國(guó)藥集團(tuán)定制);光學(xué)顯微鏡BX51(日本OLYPUS公司 );石蠟切片機(jī)RM 2245(德國(guó) LEⅠCA公司)。

1.3 方法

1.3.1 造模 30只成年雄性Wistar大鼠，高脂飼料(88.8%基礎(chǔ)飼料、1%膽固醇、10%豬油和0.2%膽鹽)飼養(yǎng)1個(gè)月后給予大鼠2%STZ一次性腹腔注射(40 mg/kg)，1 w后取尾血測(cè)血糖，以血糖＞16.7 mmol/L為糖尿病模型成功。大鼠繼續(xù)常規(guī)飼料喂養(yǎng)2個(gè)月。

1.3.2 分組及干預(yù) 將造模成功的2型糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組(DM-C組，n=10);以K-H液持續(xù)灌流120 min;糖尿病缺血-再灌注組(DM-Ⅰ/R組，n=10)，以K-H液穩(wěn)定灌流20 min后，停止灌流30 min，再灌注120 min;糖尿病高壓氧預(yù)處理組(DM-P組，n=10):先經(jīng)過高壓氧預(yù)處理，其余實(shí)驗(yàn)方法同DM-Ⅰ/R組。高壓氧預(yù)處理方法:先洗艙，以保證艙內(nèi)處于純氧狀態(tài);然后將大鼠放進(jìn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)高壓氧艙內(nèi)，以0.2 ATA/min注入純氧，至壓力達(dá)到2.0 ATA(標(biāo)準(zhǔn)大氣壓);當(dāng)壓力穩(wěn)定后，將大鼠放置60 min;達(dá)到規(guī)定后時(shí)間后，以0.2 ATA/min排放艙內(nèi)氧氣，至艙內(nèi)壓力恢復(fù)至正常，1次/d，共7 d。

1.3.3 離體大鼠心臟灌流(Langendorff)模型 Langendorff模型是在恒溫恒壓條件下，從主動(dòng)脈根部用氧飽和的K-H灌流液逆向灌流，因逆向灌注關(guān)閉了主動(dòng)脈瓣，類似于在體心臟處于舒張期，停止灌流即模擬全心缺血狀態(tài)，恢復(fù)灌流即全心再灌注開始。具體步驟:取大鼠，秤體重，按5 ml/kg給予20%烏拉坦腹腔注射麻醉后，置于動(dòng)物臺(tái)上，固定四肢。迅速開胸取出心臟并立即置于4℃ K-H緩沖液中，輕輕擠壓心室，使心腔中殘余血排除。開啟Langendorff灌流裝置，流量約10 ml/min;于液面下在1 min內(nèi)迅速把主動(dòng)脈接于灌流的套管上，將大鼠心臟懸掛于Langendorff裝置上，并以絲線結(jié)扎固定。用95%O2、5%CO2平衡的37℃ K-H液行主動(dòng)脈逆行恒壓灌流，灌流壓力為80 cmH2O。剪去左心耳，將帶有水囊的壓力換能器(事先應(yīng)排盡空氣)通過左心房插入左心室。壓力換能器的另一端接于BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，由其來記錄血流動(dòng)力學(xué)變化及室性心律失常發(fā)生率。

1.3.4 心肌梗死面積測(cè)定 灌流畢，速取心臟，冰冷生理鹽水沖洗后剪去心房及右心室，20℃ 10 min。將左心室自心尖向左心底部橫切成相等的1～2 mm厚度的數(shù)片，放棄心尖和心底部分，以朝向心尖部的切面作為面積分析切面。將心肌切片放入pH7.4，1%TTC磷酸鹽緩沖液中，濃度為0.2 mol/L，38℃孵育20 min。冷生理鹽水洗去殘余染料，非梗死心肌呈紅色，梗死心肌不著色，10%甲醛固定24 h。各標(biāo)本采用固定焦距的數(shù)碼相機(jī)照相。應(yīng)用德國(guó)Ⅰmgage tool圖像分析系統(tǒng)計(jì)算梗死面積。面積測(cè)定方法:以壞死面積之和占總面積的百分比為心肌梗死面積。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，兩組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo) DM-C組與其他兩組離體大鼠心臟平衡期血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)無明顯差異(P＞0.05)。全心灌流120 min內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)無明顯變化;DM-Ⅰ/R組缺血30 min，再灌注 10、30、60、120 min 時(shí) LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均明顯降低(P＜0.01);DM-P組在各時(shí)間點(diǎn)LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax下降幅度＜DM-Ⅰ/R組(P＜0.05)。見表1。

表1 高壓氧預(yù)處理對(duì)糖尿病大鼠離體心臟LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的影響(±s，n=10)

表1 高壓氧預(yù)處理對(duì)糖尿病大鼠離體心臟LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的影響(±s，n=10)

與DM-C組比較:1)P＜0.01;與DM-Ⅰ/R組比較:2)P＜0.05

組別 缺血即刻 再灌注后10 min 再灌注后30 min 再灌注后60 min 再灌注后120 min DM-C組 LVSP(mmHg) 84±4.43 83±3.69 76±4.94 77.83±4.62 76.67±6.44+dp/dtmax 2 859.33±227.94 2 918.15±401.12 2 985.33±414.78 2 963.17±435.90 2 920.67±553.51-dp/dtmax 2 847.5±302.63 2 874.5±447.03 2 858.33±414.02 2 853.5±428.10 2 729.67±425.15 DM-Ⅰ/R組 LVSP(mmHg) 84.17±5.31 55.83±3.061) 48±6.031) 42.67±3.721) 38.67±3.271)+dp/dtmax 2 913.17±241.55 1 797±303.621) 1 688.17±389.051) 1 465.67±264.051) 1 298.67±156.931)-dp/dtmax 2 861.17±339.43 1 994±265.741) 1 726.17±81.731) 1 619.5±34.061) 1 296.5±13.031)DM-P組 LVSP(mmHg) 82.5±6.06 61.17±4.442) 55±1.792) 49.83±5.192) 42.5±1.762)+dp/dtmax 2 906.33±469.80 2 132±71.272) 2 044±312) 1 769.17±127.352) 1 466.67±35.562)-dp/dtmax 2 899.67±371.15 2 137.83±163.092) 1 975.33±247.262) 1 721.5±87.852) 1 518.5±25.092)

2.2 再灌注后室性心律失常發(fā)生情況 DM-Ⅰ/R組發(fā)生室性心律失常(多發(fā)室性期前收縮、室性期前收縮呈二聯(lián)律或室性心動(dòng)過速)5例，DM-P組1例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 心肌梗死范圍 DM-Ⅰ/R組心肌梗死范圍為56.05%，DM-P組心肌梗死范圍為40.30%，較DM-Ⅰ/R組明顯減小(P﹤0.05)。見圖1，圖2。

圖1 糖尿病缺血再灌注組

圖2 糖尿病高壓氧預(yù)處理組

3 討論

超過1個(gè)大氣壓的壓力稱高氣壓。在高氣壓環(huán)境中吸入高濃度氧或純氧，使氧壓或氧分壓大于常壓純氧水平的氧，即稱為高壓氧。高壓氧廣泛應(yīng)用于治療缺血缺氧性疾病。研究表明〔1～4〕，高壓氧預(yù)處理可減輕大鼠的心肌缺血-再灌注損傷。但高壓氧預(yù)處理對(duì)糖尿病大鼠心肌缺血-再灌注損傷的影響至今未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建糖尿病大鼠Langendorff離體心臟灌流模型，以探討高壓氧預(yù)處理對(duì)其離體心臟缺血-再灌注損傷后心功能及心肌梗死面積的影響。

本研究顯示，離體糖尿病大鼠給予高壓氧預(yù)處理后可顯著改善再灌注后LVSP以及±dp/dtmax等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及室性心律失常的發(fā)生;同時(shí)高壓氧預(yù)處理減少了糖尿病大鼠心肌梗死面積(56.05%vs 40.30%)。考慮到在體實(shí)驗(yàn)過程中存在神經(jīng)調(diào)節(jié)和機(jī)體整體反射活動(dòng)的參與，本實(shí)驗(yàn)采用離體大鼠心臟模型，排除神經(jīng)因素和機(jī)體整體反射活動(dòng)的影響，觀察高壓氧預(yù)處理對(duì)糖尿病大鼠缺血再灌注心肌的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):高壓氧預(yù)處理能夠減輕糖尿病大鼠心肌再灌注損傷，表現(xiàn)為心肌梗死面積縮小，再灌注后室性心律失常明顯減少，血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)改善。

高壓氧可用于防治臟器的缺血再灌注損傷，包括肝臟、心臟、神經(jīng)系統(tǒng)等，關(guān)于高壓氧防治缺血再灌注損傷涉及的機(jī)制，Chaves等〔5〕研究表明，高壓氧通過抑制肝細(xì)胞的凋亡保護(hù)肝臟的缺血再灌注損傷。Yamashita等〔6〕研究表明，高壓氧預(yù)處理通過抑制P38蛋白激酶磷酸化發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，而Li等〔7〕則認(rèn)為高壓氧預(yù)處理是通過抑制線粒體凋亡途徑治療大腦的缺血再灌注損傷。關(guān)于高壓氧預(yù)處理對(duì)糖尿病大鼠缺血再灌注心肌的保護(hù)作用的機(jī)制，目前國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道。本研究表明，高壓氧預(yù)處理可抑制糖尿病大鼠心肌細(xì)胞的凋亡;但關(guān)于高壓氧預(yù)處理如何實(shí)現(xiàn)其抗細(xì)胞凋亡，涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及行高壓氧預(yù)處理的最佳療程尚有待進(jìn)一步研究。

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