氨茶堿對支氣管哮喘氣道重塑大鼠肺組織MMP-9及其基因表達的調節

段旭東 趙 輝 張雅蘭 王曉媛 王曉紅 (河北醫科大學第二醫院中醫外科，河北 石家莊 050000)

支氣管哮喘是一種臨床常見病，氣道重塑是其主要病理特征之一。研究表明〔1〕，氣道重塑是氣道炎癥基礎上氣道壁損傷在多種細胞炎癥介質、細胞因子作用下出現的不完全修復。氣道重塑是導致氣道高反應性，肺功能持續性、進行性損傷的主要原因，并可能導致頑固性哮喘，預防和逆轉氣道重塑是干預哮喘，尤其是頑固性哮喘的有效途徑。氨茶堿作為治療支氣管哮喘的經典藥物，近年來對其藥理作用的研究有頗多新的發現，但多集中于抗炎、免疫調節的作用〔2〕，對氣道重塑的影響研究較少。本實驗擬通過建立哮喘氣道重塑大鼠模型，觀察氨茶堿對支氣管哮喘大鼠轉化生長因子-β1(TGF-β1)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)及基因表達的影響，探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠24只，雌雄各半，體重180～220 g，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物學部提供提供，動物合格證號:SCXK(鄂)2004-007。20℃飼養，自由進食水。

1.2 藥物 氨茶堿，天津金耀氨基酸有限公司產品，批準文號:國藥準字 H12020978。批號:20050917，250 mg，10 ml/支。

1.3 主要儀器及試劑 HM-200MK-3酶聯免疫檢測儀:芬蘭雷勃公司生產。15K高速冷凍離心機、全自動洗板機、卵蛋白:美國Sigma公司產品。氫氧化鋁:天津市化學試劑三廠生產，分析純。MMP-9試劑盒:美國RB公司生產。756MC型紫外-可見光分光光度計:上海緊密科學儀器有限公司產品。PE9600型PCR擴增儀:美國PE公司產品。電泳儀及電泳槽:北京六一公司產品。BⅠO-PROFⅠF凝膠圖像分析儀:法國VL公司產品。NDY-1000彩色圖像分析儀:武漢同濟醫科大學千屏影像科技公司生產。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及給藥 實驗大鼠按隨機表分為正常對照組、模型組、氨茶堿治療組(以下簡稱治療組)，每組8只。治療組從第1次哮喘激發開始灌胃給藥，直至處死，2 ml每日1次，用藥劑量按有關公式〔2〕，將人體臨床用藥劑量折算為大鼠用藥劑量，模型組、正常對照組均以2 ml生理鹽水代替氨茶堿，每日1次灌胃。

1.4.2 模型建立 實驗組采用文獻中方法〔3〕，分別于第1天及第8天大鼠腹腔內注射新鮮配制的卵蛋白溶液1 ml(內含卵蛋白100 mg，氫氧化鋁100 mg)致敏，第15天起哮喘模型組及治療組開始霧化吸入1%卵蛋白激發哮喘，隔日1次，每次20 min，共6 w，以大鼠出現呼吸加快，口唇發紺，腹肌痙攣，點頭呼吸及站立不穩等表現為激發成功。正常對照組以生理鹽水代替卵蛋白進行腹腔注射及霧化吸入。

1.4.3 檢測指標及方法

1.4.3.1 病理組織學觀察 10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔內注射麻醉，麻醉完全后開胸，迅速結扎右主支氣管，取右肺中葉，4℃4%多聚甲醛固定，脫水、包埋、切片。蘇木素-伊紅(HE)染色，鏡下觀察病理學改變。并參照文獻測量大鼠氣道壁面積，并用氣管內周長(Pi)進行標準化，采用NDY1000型圖像分析儀測定完整支氣管管腔的內周長、支氣管平滑肌的面積，用Pi進行標準化。

1.4.3.2 支氣管-肺組織TGF-β1含量檢測 采用免疫組化半定量測定，石蠟切片常規脫蠟脫水，微波抗原修復，過氧化氫甲醇溶液滅活內源性過氧化物酶，滴加正常山羊封閉液，室溫反應30 min后，各組分別滴加1∶80配置的兔ⅠgG多抗，4℃過夜，PBS洗凈后，滴加生物素標記的二抗工作液，37℃反應20 min，PBS洗凈后加辣根酶標記的鏈酶卵白工作液，37℃反應20 min，PBS洗5 min，共4次，室溫顯色，鏡下控制反應時間約10 min左右，洗凈后蘇木精復染，樹膠封片。計算機圖像處理軟件半定量測定TGF-β1含量(以染色吸光度值表示)，于上下左右四點測量支氣管壁及周圍組織灰度值，取平均數作為最終測量結果。

1.4.3.3 肺組織MMP-9含量檢測 取左肺上葉，稱重后移入玻璃勻漿器中，加入2倍肺組織重量的生理鹽水，充分研磨，使組織勻漿化，制備好的勻漿3 500 r/min離心10 min提取上清液，ELⅠSA法檢測MMP-9含量。

1.4.3.4 肺組織MMP-9 mRNA含量檢測 取左肺下葉肺組織50～100 mg，采用Trizol一步法提取細胞總RNA，逆轉錄酶M-MLV進行逆轉錄及PCR擴增，合成cDNA，-20℃保存備用。PCR反應:①PCR反應體系:50μl反應體系含TaqDNA聚合酶，Dntps，上樣染料，穩定劑，反應緩沖液，逆轉錄反應產物，上下游引物等。震蕩混勻后短暫離心，加少許礦物油于PCR儀擴增。②PCR擴增引物:引物由北京塞百盛基因技術有限公司合成。MMP-9引物序列為:上游:5'-TCGGTATTGGAAGTTCTCGA ATCACGG AGG-3'，下游:5'-GGCACTGCAGGAG GTCATAGGTCACGTA-3'，擴增片段為502 bp;ⅠL-4引物序列為:上游:5'-TGATGGGTCTCAG CCCCCACCTTGC-3'，下 游:5'-CTTTCAGTGTTGTGAGCGTG GACTC-3'，擴增片段為 378 bp;βactin引物序列為:上游:5'-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3'，下游:5'-CTGGAAGGTGGACAGT GAG-3'，擴增片段為202 bp。③PCR 反應條件:ⅠL-4:94℃ 4 min，94℃ 45 s，60℃ 1 min，72℃1 min×30個循環，延伸 72℃ 10 min;MMP-9:94℃ 4 min，94℃45 s，66℃ 90 s，72℃ 75 s×30 個循環，延伸 72℃ 10 min;β-連環蛋白 (β-actin):94℃ 4 min，94℃ 45 s，55℃ 1 min，72℃1 min×30個循環，延伸72℃ 10 min。④半定量分析:取每個標本的擴增產物6μl于1%的含GV核酸染料的瓊脂糖凝膠電泳，以DNA Marker(DL2000)作為標準分子量標記，電泳后于紫外透射儀觀察，并用數碼相機照相，輸入微機應用法國VL公司BⅠO-PROFⅠF凝膠圖像分析系統Bio-ⅠD?分析軟件對目的電泳條帶進行分析，以相應的內參電泳條帶作為參照，結果以兩者之積分吸光度的比值表示。

1.5 統計學處理 應用STATA8.0統計軟件，數據采用±s表示，統計方法采用單因素方差分析及q檢驗。

2 結果

2.1 支氣管哮喘大鼠支氣管-肺組織病理學的影響 與正常組比較，模型組大鼠支氣管管壁和平滑肌厚度明顯增加(P＜0.01)，與模型組比較，治療組支氣管管壁和平滑肌厚度明顯減低(P＜0.01)。見表1，圖1。

2.2 哮喘大鼠肺組織中TGF-β1含量的變化 圖2可見，與正常組比較，模型組大鼠肺組織TGF-β1含量達247.0±18.6，較正常組143.4±18.9含量明顯增加，其差異具有統計學意義(P＜0.01)。與模型組比較，氨茶堿治療組 TGF-β1含量173.8±36.8降低，其差異具有統計學意義(P＜0.01)。

表1 各組大鼠氣道形態學的比較(±s，n=8，%)

表1 各組大鼠氣道形態學的比較(±s，n=8，%)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 劑量(mg/kg) 支氣管數 支氣管壁面積/pi(μm)支氣管平滑肌面積/pi(μm)正常組- 24 2.52±1.07 1.17±0.86模型組 - 24 7.64±1.691) 4.02±1.491)治療組 35 24 4.87±1.482) 2.76±1.082)

圖1 各組氣道形態學(HE，×400)

圖2 各組TGF-β1表達(DAB，×400)

2.3 哮喘大鼠肺組織中MMP-9、MMP-9 mRNA含量的變化與正常組比較，模型組大鼠肺組織MMP-9含量、MMP-9 mRNA表達水平均明顯增加(P＜0.01)。與模型組比較，氨茶堿治療組MMP-9含量、MMP-9 mRNA表達水平均降低，其差異具有統計學意義(P＜0.01)。見表2，圖3。

表2 氣道重塑大鼠肺組織中MMP-9、MMP-9 mRNA含量的變化(±s，n=8)

表2 氣道重塑大鼠肺組織中MMP-9、MMP-9 mRNA含量的變化(±s，n=8)

與正常組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01

組別 劑量(mg/kg)MMP-9(pg/g)MMP-9mRNA(MMP-9/β-actin)正常組- 32.8±10.9 17.60±9.40模型組 - 88.1±23.81) 89.75±7.911)治療組 35.0 43.1±16.52) 57.89±13.882)

圖3 各組鼠肺組織中MMP-9 mRNA含量

3 討論

應用氨茶堿治療哮喘已有80多年的歷史，口服或直腸給藥吸收迅速，有效血藥濃度為 10～20 mg/L，理論上給予0.5 mg/kg氨茶堿可使血清藥物濃度上升1 mg/L，其治療劑量與中毒劑量十分接近，20 mg/L血藥濃度即可出現中毒反應，血清藥物濃度大于35 mg/L時可引起呼吸急促、驚厥甚至死亡〔4〕。本實驗中原設置的高劑量氨茶堿(70 mg/kg)組實驗動物，用藥后呼吸興奮、驚厥等中毒反應明顯，并有數只在實驗過程中死亡，無法進行統計處理。

氨茶堿可下調大鼠肺組織MMP-9 mRNA表達、抑制MMP-9合成，從而抑制氣道重塑。研究表明，MMP-9與支氣管哮喘氣道炎癥、氣道重塑、氣道高反應性和激素治療效果等方面均有密切關系〔5〕，健康成人肺組織中MMP-9含量較少，但在哮喘及氣道重塑過程中，MMP-9可大量增加，哮喘時，肺的結構細胞如成纖維細胞、上皮細胞、氣道平滑肌細胞以及許多炎癥細胞如肺泡巨噬細胞、中性粒細胞、噬酸性粒細胞、淋巴細胞、肥大細胞等均可產生 MMP-9。哮喘狀態下，支氣管肺泡灌洗液(BALF)、痰液和血清中均可見MMP-9的濃度增加，氣道活檢組織表達MMP-9mRNA 及其活性升高〔6～8〕。Cataldo等的研究表明，哮喘抗原刺激后，痰液中MMP-9的含量增加，且其水平與1 s用力呼氣量(FEV1)呈負相關。而減低MMP-9的含量可增加FEV1〔9〕。MMP-9與氣道重塑關系密切，氣道重塑是氣道反復炎癥損傷修復的結果，主要表現為細胞外基質(ECM)的沉積、基底膜增厚，氣道平滑肌增生肥厚等改變。Hoshino研究顯示哮喘氣道重塑患者氣道上皮下組織中MMP-9含量明顯升高，而MMP-9含量與患者氣道上皮下組織中Ⅲ、Ⅴ型膠原及黏蛋白含量顯著正相關，而皮質類固醇類藥物可通過下調MMP-9含量而抑制氣道重塑〔10〕。

TGF-β1是一種多功能的調節細胞生長、分化的細胞因子，在哮喘的發生發展過程中起著重要的作用，哮喘患者的TGF-β1主要由氣道上皮細胞、成纖維細胞及嗜酸粒細胞(EOS)產生，氣道中TGF-β1表達增高可刺激氣道平滑肌細胞分裂與增殖，刺激氣道平滑肌細胞產生ⅠL-8及前列腺素E2以參與氣道炎癥反應。在氣道重塑過程中，可誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，增加纖維黏蛋白和膠原的合成及在細胞外基質的沉積，同時還抑制膠原酶和蛋白酶的產生以減少膠原降解。TGF-β1的表達與氣道基底膜厚度、成纖維細胞數目及哮喘發作的嚴重程度正相關〔11〕。

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