還原型谷胱甘肽對糖尿病大鼠MDA和TAOC的影響

金開山 田海榮 秦文浩 (上海華東療養(yǎng)院，江蘇 無錫 4065)

還原型谷胱甘肽(GSH)是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種生物活性肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，含有巰基，是細胞內(nèi)重要的還原劑，對過氧化物、自由基和親電子基起拮抗作用，能清除過氧化代謝產(chǎn)物，阻斷脂質(zhì)過氧化反應，從而起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用〔1，2〕。本研究通過觀察血清及心臟、肝臟、胰腺、腎臟組織勻漿中丙二醛(MDA)和總抗氧化能力(TAOC)的變化，了解GSH對糖尿病(DM)大鼠抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 SD雄性健康大鼠(150～170 g)50只，購自南通大學醫(yī)學院實驗動物中心。鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma化學公司。GSH注射液(泰特，600 mg/支)購自香港銓福發(fā)展有限公司。魚精蛋白鋅胰島素(PZⅠ)購自上海第一生化藥業(yè)有限公司。Accu-Chek血糖儀及血糖試紙條由羅氏診斷產(chǎn)品有限公司提供。尿糖試紙為蘇州醫(yī)藥集團有限公司產(chǎn)品。糖化血清蛋白(GSP)、MDA、TAOC檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 取SD大鼠40只，禁食不禁水12 h，按65 mg/kg腹腔注射STZ(臨用前溶于0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，配成濃度為10 mg/ml，pH4.4)造模。另8只同齡大鼠腹腔注射6.5 ml/kg檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射STZ后72 h測血糖＞16.7 mmol/L，尿糖3+～4+，持續(xù)2 d并出現(xiàn)多飲、多食、多尿，體重下降，確定DM模型成立。

1.2.2 實驗分組和處理 10只腹腔注射不含STZ緩沖液的同齡大鼠為正常對照組。DM大鼠成模32只，參照隨機血糖和體重分為3組:(1)DM對照組(n=11);(2)腹腔注射GSH(150 mg/kg，1次/d)的DM組(GSH組，n=11);(3)皮下注射PZⅠ(每天予 PZⅠ10～20 U/kg)控制隨機血糖在 4～8 mmol/L、尿糖陰性的PZⅠ組(n=10)。治療前測各組空腹血糖(FPG)。治療2 w后測四組大鼠FPG、GSP、MDA和TAOC。治療4 w后檢測四組大鼠FPG、GSP、MDA和TAOC以及心臟、肝臟、胰腺、腎臟組織勻漿的MDA和TAOC。

1.2.3 觀察指標檢測 通過裁尾法獲取一滴血，用Accu-Chek血糖儀及血糖試紙條檢測隨機血糖和FPG。用代謝籠收集少許尿液以尿糖試紙檢測尿糖。眼眥靜脈采血檢測血清GSP、MDA、TAOC。組織勻漿的制備及所有GSP、MDA、TAOC的檢測嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，單因素采用方差分析(ONE-WAY ANOVA)，組間比較采用 Student-Newman-Keuls法。

2 結(jié)果

2.1 FPG和GSP的變化 FPG治療前DM對照組為(15.86±0.689 4)mmol/L、GSH 組(15.92 ± 0.588 4)mmol/L，PZⅠ組(15.89±0.783 1)mmol/L，均顯著高于正常對照組〔(5.48±0.221 6)mmol/L，P ＜0.01〕，DM 對照組、GSH 組和 PZⅠ組之間無差異，表明DM大鼠分組均衡。2、4 w后FPG和GSP變化見表1。

2.2 MDA變化 2 w時GSH組、DM對照組血清MDA高于正常對照組(P＜0.01)，PZⅠ組與正常對照組比較無統(tǒng)計學差異，GSH組低于DM對照組(P＜0.05)。4 w時GSH組、DM對照組血清MDA高于正常對照組(P＜0.01)，GSH組低于DM對照組(P＜0.01)。DM對照組4 w時血清MDA較2 w時增高(P＜0.05)，但GSH組無此差異。4 w時DM對照組、GSH組心、肝、胰、腎組織 MDA均高于正常對照組和 PZⅠ組(P＜0.01)，GSH組除胰腺外，心、肝、腎組織MDA均低于DM對照組(P＜0.05)。見表2。

2.3 TAOC變化 2、4 w時GSH組、DM對照組血清TAOC均低于正常對照組、PZⅠ組(P＜0.01)，但GSH組與DM對照組比較血清TAOC增高(P＜0.05)。2 w與4 w時比較，GSH組、DM對照組血清TAOC無統(tǒng)計學意義。PZⅠ組2 w時血清TAOC低于正常對照組(P＜0.05)，但4 w時無統(tǒng)計學意義。

GSH組、DM對照組心、肝、胰、腎組織TAOC均低于正常對照組和PZⅠ組(P＜0.01)。GSH組除胰腺外，心、肝、腎組織與DM對照組比較TAOC均增高(P＜0.05)。而 PZⅠ組除胰腺TAOC仍低于正常對照組(P＜0.05)，心、肝、腎組織與正常對照組比較無統(tǒng)計學差異。見表3。

表1 四組大鼠血清FPG和GSP的變化(±s，mmol/L)

表1 四組大鼠血清FPG和GSP的變化(±s，mmol/L)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與2 w時比較:2)P＜0.05

組別 n FPG 2 w 4 w GSP 2 w 4 w正常對照組 10 5.08±0.388 7 5.26±0.472 0 2.08±0.144 5 2.06±0.158 8 DM對照組 11 18.83±0.648 61) 19.78±0.905 61)2) 4.04±0.403 91) 4.46±0.425 441)2)GSH組 11 17.80±0.762 31) 18.74±0.893 31)2) 4.08±0.223 71) 4.39±0.306 11)2)PZⅠ組 10 6.18±0.654 4 5.82±0.809 4 2.11±0.194 6 2.19±0.145 2

表2 四組大鼠血清和組織MDA含量的變化(±s)

表2 四組大鼠血清和組織MDA含量的變化(±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與DM對照組比較:2)P＜0.01，3)P＜0.05;與2 w時比較:4)P＜0.05

組別 n 血清(nmol/ml)2 w 4 w組織勻漿(nmol/mgprot)心臟 肝臟 胰腺 腎臟正常對照組 10 5.05±1.304 3 5.26±0.753 8 4.01±0.177 5 2.44±0.350 7 0.43±0.312 2 7.14±0.522 1 DM對照組 11 11.53±2.319 61) 13.19±2.690 51)4) 8.36±0.296 61) 5.02±0.284 51) 1.22±0.186 41) 12.47±0.544 11)GSH組 11 9.74±1.436 31)3) 9.37±2.323 41)3) 8.09±0.159 21)3) 4.75±0.263 51)3) 1.16±0.415 81) 11.85±0.718 81)3)PZⅠ組 10 5.28±1.332 1 5.31±0.946 2 4.14±0.105 8 2.63±0.163 7 0.47±0.146 1 7.58±0.483 7

表3 四組大鼠血清和組織TAOC含量的變化(±s)

表3 四組大鼠血清和組織TAOC含量的變化(±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與DM對照組比較:3)P＜0.05

組別 n 血清(nmol/ml)2 w 4 w組織勻漿(nmol/mgprot)心臟 肝臟 胰腺 腎臟正常對照組 10 8.68±1.050 3 8.74±0.894 2 0.50±0.057 4 1.26±0.127 1 0.85±0.226 0 1.12±0.222 9 DM對照組 11 4.78±0.596 11) 4.36±0.745 11) 0.27±0.104 51) 0.44±0.091 11) 0.28±0.058 91) 0.35±0.033 21)GSH組 11 5.46±0.760 31)3) 5.27±1.031 41)3) 0.38±0.125 11)3) 0.56±0.108 61)3) 0.33±0.076 91) 0.43±0.090 31)3)PZⅠ組 10 7.45±1.352 12) 8.02±0.837 4 0.48±0.152 5 1.17±0.080 7 0.69±0.084 62)1.05±0.266 4

3 討論

STZ是目前實驗中最常用于制備DM模型的試劑，可選擇性破壞大鼠胰島β細胞，使胰島素分泌減少，血糖增高。高糖狀態(tài)下，由于糖基化蛋白質(zhì)的氧化、細胞質(zhì)內(nèi)醛還原反應、兒茶酚胺分泌增多與氧化增強、還原型輔酶Ⅱ(NADPH)的合成不足等原因致使體內(nèi)氧自由基增高，引起多種氧化損傷;細胞膜多不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應，形成脂質(zhì)過氧化物(如MDA等)〔3〕。血清中的TAOC主要是血清中非酶促體系的抗氧化物質(zhì)和酶促體系少數(shù)小分子量抗氧化物質(zhì)的總和，是反映機體抗氧化作用的重要指標之一。高糖狀態(tài)下，TAOC也明顯減弱〔4〕。本研究中DM對照組、GSH組血清和組織MDA、TAOC的改變與這些結(jié)論相符。

有研究顯示，補充外源性還原型GSH能恢復GSH酶系活性，阻斷氧自由基對心肌的損害，可以預防、減輕、終止組織細胞損傷，改變病理過程，在保護心肌細胞方面具有良好的作用〔5〕。而且，GSH作為過氧化物酶的底物，能清除細胞內(nèi)的過氧化氫及脂過氧化物，也可單獨與許多自由基如烷自由基、過氧自由基、半醌自由基等作用，是生物機體內(nèi)的自由基清除劑，具有抗線粒體脂質(zhì)過氧化作用，還可降低受損傷體系中線粒體膜膽固醇水平，使膜的流動性有所增加，起到保護肝臟、腎臟的作用〔6，7〕。本研究中GSH組血清和組織 MDA、TAOC的改變也與這些結(jié)論相符。

本研究結(jié)果顯示2、4 w時GSH組血清FPG和GSP與DM對照組變化一致，而血清MDA顯著降低、血清TAOC升高。在各種組織也表現(xiàn)為多數(shù)組織MDA降低和TAOC升高。這表明GSH引起的MDA和TAOC變化不是通過影響血糖來實現(xiàn)的，有其獨立的途徑。提示在DM治療中，抗氧化治療可作為治療內(nèi)容之一。但4 w時GSH組血清MDA及TAOC與2 w時比較并無進一步顯著改變，其機制有待進一步研究。另外，不同濃度GSH對組織的影響可能不同〔7〕，就單個器官而言，其最佳藥物治療濃度也有待進一步研究。考慮到高血糖因素，本研究設計了血糖嚴格控制的PZⅠ組。由于GSP是評價DM患者取樣前2～3 w血糖控制情況的良好指標，不受血紅蛋白變異或其他可促進紅細胞更新因素的影響，評價、監(jiān)控DM的療效迅速、靈敏、特異〔8〕，故以GSP來評價PZⅠ組血糖控制良好。PZⅠ組多數(shù)組織的MDA和TAOC能恢復至正常，提示胰島素治療不僅可很好控制血糖，同時可明顯提高機體的抗氧化能力。但在4 w時，即使完全糾正高血糖，也不能使某些組織(如胰腺)的MDA和TAOC恢復正常，是因為STZ對胰腺的損害難以逆轉(zhuǎn)，還是實驗的時間不夠長，有待進一步研究。

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