女貞子、淫羊藿補腎中藥對自發性高血壓大鼠主動脈內皮舒縮功能的影響

王雪冰 張 磊 田 允 蔡 晶 (深圳市平樂骨傷科醫院，廣東 深圳 518010)

補腎中藥女貞子為木樨科常綠喬木女貞子(Ligustrum lucidum Ait)干燥成熟果實〔1〕，味甘苦，性涼，歸肝腎經，有滋補肝腎、明目烏發的功效，主要用于眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發早白、目暗不明等癥〔2〕。淫羊藿(小檗科箭葉淫羊藿 Epimedium sagittatum，產地四川)的干燥地上部分，為我國傳統補益中藥，歷代本草均有記載。李時珍在《本草綱目》中稱其有“辛溫，無毒，堅筋骨，益精氣，補腰膝，強心力”之功效。目前臨床應用遠遠超過了古人論述的范圍，諸多醫家經常將其與其他藥物配伍，治療高血壓。臨床經驗及諸多醫家報道〔3～5〕，降壓西藥結合以補腎中藥為主藥的中藥復方治療原發性高血壓，其療效較單純應用降壓西藥為好。我們猜測補腎中藥女貞子、淫羊藿減輕高血壓患者癥狀的藥理基礎可能和心血管的神經內分泌調節有關。本課題利用自發性高血壓大鼠(SHR)模型，探討補腎中藥對SHR血管內皮舒張因子NO、收縮因子ET-1及其相應的eNOS、ET-1蛋白和eNOSmRNA、ET-1 mRNA的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 12～14周齡自發性高血壓大鼠(SHR)40只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司〔合格證號:NO.SOXK(京)2007-0001〕，雌雄各半，體重(250±10)g;另購同齡同種系京都種大鼠(WKY)10只，雌雄各半，體重(238±10)g，實驗前置于福建中醫學院動物實驗中心清潔級動物室適應性飼養1 w，室溫20℃ ～22℃。大鼠全價顆粒飼料由福建中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.2 實驗藥物與試劑 女貞子(木犀科常綠喬木女貞Ligustrum lucidum Ait.的成熟果實，產地福建，由福建醫藥集團提供)，淫羊藿(小檗科箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum，產地四川，由福建醫藥集團提供);依那普利(5 mg*16片)為揚子江藥業集團產品，批號:國藥準字H32026568。NO試劑盒(硝酸還原酶法)由南京建成生物工程研究所提供(批號:20071206)，ET(批號:S10950212)放免試劑盒由北京普爾偉業生物科技有限公司提供。eNOS、ET-1抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。引物由Primer Premier 5.0設計，由Sigma公司合成。引物序列見表1。

表1 各引物序列及PCR產物片段長度

1.3 實驗藥物制備 女貞子、淫羊藿各38 g，加入500 ml蒸餾水中，浸泡60 min后，煎煮300 ml藥液，過濾后裝瓶密封消毒，4℃冷藏。依那普利25.2 mg，用雙蒸水溶解配成300 ml的水溶液，裝瓶密封消毒，4℃冷藏。

1.4 實驗動物分組與給藥 將40只SHR隨機分組為女貞子組、淫羊藿組、陽性對照組、模型組，每組10只(雌雄各半);另外10只(雌雄各半)京都種大鼠(WKY)作為正常對照組。①女貞子組灌服女貞子水煎液1.58 g·kg-1·d-1，相當于成人常用量。②淫羊藿組灌服淫羊藿水煎液1.58 g·kg-1·d-1，相當于成人常用量。③陽性對照組給予依那普利水溶液1.07 mg·kg-1·d-1，相當于成人常用量。④模型組和正常對照組均灌服同體積的蒸餾水。2次/d灌服，連續灌胃2 w。

1.5 實驗儀器 半自動分光光度計BT-224(意大利生物技術公司)，Y放射免疫計數儀 FJ-2008PS(西安核儀器廠);包埋機，病理切片機，倒置光學顯微鏡數字圖像分析系統Ⅰmage Pro Plus 6.0。電泳儀 Biometra公司，型號 High vohag power pack p30;核酸蛋白分析儀Amemham biosciences公司型號Ultrospec 2100pro;臺式高速冷凍離心機Hettieh公司，型號Mikro 22R;凝膠成像系統Kodak公司，型號GL200;梯度PCR儀Biometry公司，型號96T;實時熒光定量PCR儀ABⅠ公司，型號7500型。以上儀器均由福建中醫藥大學中西醫結合研究院重點實驗室提供。

1.6 血壓的測定 給藥前SHR大鼠血壓由動物單位提供;給藥結束后24 h，大鼠麻醉成功，常規消毒，剪去頸部右側的毛，沿胸鎖乳突肌內緣將筋膜分開，即可見右頸總動脈與迷走神經，輕輕分離出右頸總動脈一段(2～3 cm)，穿過兩根結扎線，一根扎住遠心端，用動脈夾夾住近心端，在靠近近心端結扎線的部位用眼科小剪刀剪一“V”形小口，插入已經注滿肝素(40 U/ml)、0.9%生理鹽水的PE-50乙烯管(內徑0.5 mm，外徑1 mm)，用近心端的線固定，打開動脈夾，血流通暢后壓力信號經A/D卡輸入計算機進行貯存，打印，輸出，檢測出大鼠血壓值(收縮壓SBP)。

1.7 血清NO、血漿ET-1的測定

1.7.1 血液標本的采集 給大鼠稱重，腹腔注射氯氨酮(0.3 ml/100 g)麻醉，麻醉成功后，常規消毒，腹主動脈采血。其中1 ml注入無抗凝劑的離心管中，低溫離心(4℃、3 000 r/min、15 min)，收集上清-20℃保存以備同批測定。取2 ml注入含10%的EDTA二鈉30μl和抑肽酶40μl的試管中，混勻，4℃，3 000 r/min離心 10 min，分離血漿，收集血漿-20℃保存以備同批測定。

1.7.2 血清NO與血漿ET的測定 血清NO用半自動分光光度計采用硝酸還原酶法測定，以μmol/L為單位。血漿ET-1采用放射免疫分析法檢測，以pg/ml為單位，操作均嚴格按試劑盒說明書進行。

1.8 主動脈內皮eNOS、ET-1蛋白表達的檢測 取2 cm主動脈置于10%甲醛中浸泡固定，包埋，輪轉式切片機橫斷面連續切片，厚度為4μm，烤片60 min，脫蠟，水化，3%H2O2預處理，5%BSA室溫封閉20 min，抗eNOS抗體(稀釋度1∶50)和抗ET-1抗體(稀釋度1∶200)分別加入鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶依次反應和洗滌后，以DAB染色試劑盒顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以光鏡下主動脈內皮細胞胞漿染成淺黃色、棕黃色或棕褐色為陽性著色。按陽性染色細胞所占比例分為3級:陽性染色細胞占15%～35%為弱陽性反應(+);陽性染色細胞占36%～75%為陽性反應(?);陽性染色細胞占75%以上為強陽性反應(?);利用顯微攝像系統在400倍下，每組隨機選取10個視野，采用Ⅰmage Pro Plus 6.0圖像分析軟件半定量分析目的蛋白的表達量，測定主動脈內膜eNOS、ET-1蛋白表達的平均光密度值。

1.9 主動脈內皮eNOSmRNA、ET-1 mRNA的檢測 取材后的標本凍存于-80℃冰箱中凍存備用。按照Ⅰnvitrogen公司的TRⅠZOL總RNA提取試劑盒說明書提取組織總的RNA。采用兩步RT-PCR法進行測定eNOSmRNA、ET-1 mRNA的表達。

1.10 統計分析 所有數據應用SPSS15.0統計軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，組間差異采用方差分析、兩兩比較的q檢驗或連續校正t檢驗。

2 結果

2.1 用藥前后各組大鼠血壓值(收縮壓SBP)的變化 從表2可見:用藥前女貞子組、淫羊藿組、陽性對照組、模型組四組大鼠的血壓均高于正常組(P＜0.05);用藥后女貞子組、淫羊藿組大鼠的血壓較用藥前略有下降，但與模型組無差異(P＞0.05)，明顯高于正常組(P＜0.05)，用藥后陽性對照組大鼠的血壓較用藥前顯著降低(P＜0.05)，與正常組無差異(P＞0.05)。

表2 用藥前后各組大鼠血壓值的比較(±s，mmHg)

表2 用藥前后各組大鼠血壓值的比較(±s，mmHg)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05;與用藥前比較:3)P＜0.05

組別 n 給藥前 給藥后女貞子組 10 184.8±15.91) 179.3±10.41)淫羊藿組 10 186.5±17.81) 172.4±9.91)陽性對照組 10 181.2±8.91) 141.8±14.52)3)模型組 10 186.3±14.21) 185.8±7.01)正常組10 136.6±22.6 135.5±16.1

2.2 各組大鼠用藥后血清NO、ET比較結果 如表3，與正常組比較，模型組大鼠NO含量明顯降低(P＜0.05)，ET-1含量顯著升高(P＜0.05);女貞子組、淫羊藿組、陽性對照組NO含量與模型組比較顯著增加(P＜0.05)，與正常組無差異(P＞0.05);女貞子組、淫羊藿組、陽性對照組ET-1含量顯著降低(P＜0.05)，與正常組無差異(P＞0.05)。

表3 給藥后SHR血清NO、ET-1含量(±s)

表3 給藥后SHR血清NO、ET-1含量(±s)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 n NO(μmol/L) ET-1(pg/ml)女貞子組 10 35.51±6.772) 95.40±8.572)淫羊藿組 10 35.15±7.002) 98.98±10.422)陽性對照組 10 39.00±5.842) 78.06±26.102)模型組 10 16.92±5.841) 136.92±39.381)正常組10 45.10±7.31 76.09±20.30

2.3 各組大鼠主動脈內皮細胞eNOS蛋白、ET-1蛋白的表達

模型組大鼠主動脈內皮細胞eNOS很低表達，ET-1表達呈強陽性，與正常組比較有顯著差異(P＜0.05);女貞子組、陽性對照組主動脈內皮細胞eNOS表達呈強陽性表達，淫羊藿組主動脈內皮細胞eNOS表達呈弱陽性表達，三組與模型組比較有差異(P＜0.05);女貞子、淫羊藿組、陽性對照組的ET-1呈陰性表達，與模型組有差異(P＜0.05);正常組大鼠主動脈內皮細胞eNOS表達呈強陽性反應，而ET-1呈陰性表達。見表4。

表4 用藥后各組大鼠主動脈內皮eNOS、ET-1表達的比較(±s)

表4 用藥后各組大鼠主動脈內皮eNOS、ET-1表達的比較(±s)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 n eNOS ET-1女貞子組 10 0.499±0.0442) 0.323±0.0412)淫羊藿組 10 0.488±0.0692) 0.339±0.0792)陽性對照組 10 0.511±0.0452) 0.316±0.0832)模型組 10 0.394±0.0641) 0.523±0.0751)正常組10 0.553±0.093 0.310±0.089

2.4 各組大鼠主動脈血管內皮eNOSmRNA、ET-1 mRNA的表達

2.4.1 eNOS、ET-1和GAPDH基因的定性結果 分別擴增eNOS、ET-1和GAPDH三個基因片段，瓊脂糖凝膠電泳分析結果表明PCR產物的大小分別約為418 bp，594 bp，502 bp，與預期設計的擴增產物片段大小基本相符。

2.4.2 主動脈血管內皮eNOSmRNA、ET-1 mRNA的表達 如表5所示:模型組大鼠主動脈內皮eNOSmRNA較正常組明顯降低，而ET-1 mRNA表達增加(P＜0.05);女貞子、淫羊藿組大鼠主動脈內皮eNOSmRNA表達明顯增加，與模型組比較有差異(P＜0.05)，ET-1 mRNA表達明顯減少，與模型組差異有統計學意義(P＜0.05)，與正常組和陽性對照組無顯著差異。

表5 給藥后各組大鼠主動脈內皮及eNOSmRNA、ET-1 mRNA表達(±s)

表5 給藥后各組大鼠主動脈內皮及eNOSmRNA、ET-1 mRNA表達(±s)

與正常組比較:1)P＜0.05;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 n eNOSmRNA ET-1 mRNA女貞子組 10 0.46±0.0052) 0.43±0.0032)淫羊藿組 10 0.49±0.0022) 0.45±0.0032)陽性對照組 10 0.58±0.0062) 0.24±0.0022)模型組 10 0.28±0.0021) 0.58±0.0051)正常組10 0.49±0.004 0.21±0.004

3 討論

1993年Ross〔6〕提出內皮功能障礙概念，逐漸深入認識血管內皮細胞(VEC)的功能作用。細胞內NO由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)催化下合成，有三種一氧化氮合成酶(NOS)，其中eNOS(即NOSⅢ或NOS3)主要存在于血管內皮細胞，參與動靜脈血流動力學調節，與心腦血管疾病的關系較為密切NOS是NO合成的關鍵酶，eNOS介導的內皮細胞釋放的基礎NO在調節血流和血壓方面起到重要作用，可以通過調節eNOS蛋白的表達來調節NO的生成。VEC不僅僅具有屏障作用，還是體內最大的內分泌器官，具有強大的內分泌、自分泌、旁分泌功能，其通過釋放血管內皮依賴性舒張因子和收縮因子調節血管平滑肌細胞以維持血管張力，其中NO是血管內皮舒張因子之一;ET是血管內皮收縮因子。ET和NO是一對矛盾統一體二者相互平衡，共同維持血管的張力，維持血管的舒張和收縮功能。血管細胞內分泌功能異常，特別是NO和ET間平衡關系的破壞，必然導致血管舒縮功能紊亂，可表現為血壓升高，NO、ET、合成釋放失衡是高血壓病的重要因素。鑒于原發性高血壓的一個重要發病機制就是血管內皮舒縮功能障礙，我們猜測補腎中藥為主藥的中藥復方改善高血壓病臨床癥狀的藥理基礎可能與血管內皮舒縮功能的調節有關，而自發性高血壓大鼠是目前公認的最接近人類原發性高血壓的動物模型〔6～8〕。

中醫認為，高血壓的基本病機性質是本虛標實，肝腎陰虛為本，肝陽上亢為標，根據中醫治病求本的原則，治以滋補肝腎為主，本研究采用補腎中藥女貞子、淫羊藿，探討補腎中藥調節主動脈內皮舒縮因子的分泌，改善主動脈內皮舒縮功能的可能機制。本實驗結果顯示用藥前女貞子組、淫羊藿組、陽性對照組、模型組四組大鼠的血壓均高于正常組;用藥后陽性對照組大鼠的血壓較用藥前顯著降低，女貞子組、淫羊藿組大鼠的血壓較用藥前均略有下降，但與模型組大鼠血壓無顯著性差異，雖然單味補腎中藥女貞子、淫羊藿沒有明顯降低血壓，但略有下降的趨勢與中醫理論、文獻報道以及臨床研究所發現的補腎中藥為主的復方改善高血壓病臨床癥狀這一結論是一致的。

本研究結果提示補腎中藥女貞子、淫羊藿能增加主動脈內皮舒張因子NO及其蛋白和基因的表達和降低收縮因子ET及其蛋白和基因的表達，因此單味中藥女貞子、淫羊藿沒有明顯降低血壓，但略有下降的趨勢，且能調節主動脈血管內皮舒縮因子，我們推測補腎中藥為主的中藥復方改善高血壓患者的臨床癥狀可能與其調節主動脈內皮舒縮因子的分泌，改善主動脈內皮舒縮功能有關。

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