應用細胞病毒抑制法測定干擾素生物學活性

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(1.長春中醫藥大學藥學院,吉林 長春 130012；2.長春金賽藥業有限責任公司，吉林 長春 130012)

《細胞病毒抑制法》是進行干擾素生物學活性測定的方法，現已收錄在《中國藥典》3部附錄[1]，此法是進行干擾素生物學活性測定的依據和標準，但是此方法實施環節多，影響因素多，這就要求實驗者在進行此實驗時了解影響實驗的各項因素，避免在各環節出現錯誤，從而得出準確的結果。

1 材料與方法

1.1 儀器 恒溫磁力攪拌器(上海雷磁儀器廠)；百級超凈臺；酶標儀(anthos 2010)。

1.2 試劑及藥品 人羊膜細胞(中國藥品生物制品檢定所生化室)；MEM培養基(Gibicol)；重組人干擾素α2b活性標準品(中國藥品生物制品檢定所)；VSV病毒(中國藥品生物制品檢定所生化室)；胎牛血清(中國醫學科學院生物工程研究所 TBD0012HYX)；乙醇(北京化工廠20061115)。

1.3 培養基的滅菌方式及存放時間[2-3]

1.3.1 培養基的滅菌方式 培養基為MEM培養基分為3種：完全培養基(含10%胎牛血清)，測定培養基(含7%胎牛血清)，攻毒培養基(含3%胎牛血清)。同時在培養基中加入雙抗(青霉素和鏈霉素)。

1.3.2 培養基的存放條件及時間 液體培養基要存放在冷藏箱中,通常液體培養基在冷藏條件下可存放6個月～1年。

1.4 凍存細胞的復蘇及復蘇濃度 將取出的凍存細胞迅速至于40 ℃溫水中,使凍存管中的物質在1 min內融化，加于10 mL完全培養基中。在進行實驗時發現，凍存細胞的數量過少，不利于細胞的復蘇，細胞生長緩慢，狀態欠佳。所以在凍存細胞時細胞的數量要適中，以利于復蘇后細胞的生長。同時，在實驗過程中，要及時進行狀態最佳細胞的再凍存工作，這樣有利于細胞的再應用。

1.5 消化時間及細胞狀態觀察 按照《中國藥典》[1]規定進行配制。在使用前，消化液應置于室溫平衡后使用。消化的時間范圍約為15～30 min，同時應根據細胞的狀態結束消化時間。

1.6 鋪板 按照《中國藥典》[1]要求進行鋪板，在鋪板時應使用準確性高的槍頭，如進口槍頭，避免液體掛壁帶來的影響；排槍在細胞培養中是常用的儀器，使用排槍時應傾斜45°，液體吸取完畢時，將槍頭在盛裝液體的器皿空白處劃出，將掛在槍頭外壁的多余液體留在器皿空白處。在向孔中排出液體完畢時，將槍頭從孔中劃出，將槍頭內的剩余液體留在孔內，以確保在鋪板時，每孔體積的準確性。

1.7 加樣 向孔內添加需要測定的樣品時，應注意加入樣品的體積的準確性，操作方法如1.6。

1.8 病毒攻擊

1.8.1 病毒保存地點 病毒攻擊是此法中重要的環節，此法中使用的病毒為VSV病毒(水泡性口炎病毒)，需保存在-70 ℃冰箱中保存。

1.8.2 加病毒時間 將病毒從-70 ℃冰箱中取出,應在10 min之內，將病毒加至細胞培養板中，病毒在室溫條件下，毒力會隨著時間的推移降低，為準確反映病毒毒力，所以這個步驟要迅速。

1.9 細胞病變點的觀察 經過反復實驗，可知，細胞病變點的觀察應結合2個原則:1)標準品A行細胞基本無死亡且H行細胞基本全部死亡；2)標準品D行或E行半數細胞死亡點。

1.10 細胞培養板脫色 《中國藥典》[1]中規定，使用流水進行染色細胞培養板的脫色，但是由于流水速度難以控制，力量不均勻，不利于操作，所以經過反復實驗，采用的方法為：用盆接水，將細胞培養板放入盆內沖洗，換水3次，沖洗3次，即可洗去浮色，脫色完成。

2 結果

2.1 培養基的滅菌方式及存放時間 應用0.2 μm濾器進行培養基的滅菌處理，防止高溫滅菌對培養基成分的破壞。

在實際操作中，為防止培養基存放時間過長對細胞生長不利，培養基的配制量應不超過2周為宜。培養基在使用前需37 ℃預熱或在室溫平衡后再使用。

2.2 細胞狀態決定消化時間及效果 倒置顯微鏡下觀察培養的貼壁細胞貼在細胞培養瓶表面生長，形態正常，狀態為致密單層。

將細胞培養瓶從二氧化碳恒溫培養箱中拿出后，放置于室溫，加入一定量消化液，消化一段時間后，顯微鏡下觀察細胞基本皺縮變圓。

消化過度則對細胞的活性損傷較大，并有部分細胞漂浮，隨棄去的消化液流失；消化不足則細胞難于從瓶壁上吹下，反復吹打同樣也會損傷細胞活性。所以在應消化至可輕吹或隨培養基輕搖下最好。

2.3 細胞病變點觀察

2.3.1 加入VSV病毒進行攻擊，細胞培養板中，正常的攻擊狀態是：干擾素生物學活性標準品A行細胞基本無死亡且H行細胞基本全部死亡。

2.3.2 加入VSV病毒進行攻擊，細胞培養板中，正常的攻擊狀態是：標準品D行或E行出現細胞半數死亡點。

3 結論

《細胞病毒抑制法》為干擾素生物學活性檢測方法，是各研究所和醫藥企業進行干擾素生物學活性檢定的標準，但是目前，由于各檢定場所環境和人員操作的不同，導致應用此方法對干擾素生物學活性檢測的結果重復性差。要求操作人員對此方法的熟練程度高，且應掌握各環節對實驗結果的影響，本實驗對各環節的影響因素進行了重復實驗，試圖通過實驗消除各環節的影響，從而利于操作人員對實驗的把握[4-5]。

[1]中華人民共和國家藥典委員會.中國藥典(三部)[M].北京：化學工業出版社,2005:附錄56.

[2]黃志榮.MTT比色法在干擾素生物學活性測定中應用的探討[J].海峽藥學,2006,18(6):23-26.

[3]劉鐵成,于淼,曹翎婕.重組人α-2b型干擾素生物學活性測定方法的改進[J].黑龍江醫藥,2000,13(4):15-18.

[4]韓蕾,黎耕.重組人干細胞生長因子(rhSCF)生物活性測定方法研究[J].中國藥學雜志,2004,39(2):56-59.

[5]賈茜,周興軍.重組人粒細胞集落刺激因子生物學活性測定方法研究[J].中國生化藥物雜志,2001,22(1):89-91.