高效液相色譜法測定吉非替尼的含量

吳麗明 黃國紅 李慶國

吉非替尼，又名易瑞沙（商品名），由英國阿斯利康醫藥公司研發，于2005年2月25日經國家食品藥品監督管理局批準正式在中國上市，用于治療既往接受過化學治療的局部晚期或轉移性非小細胞肺癌。吉非替尼是一種選擇性表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）酪氨酸激酶抑制劑，該酶通常表達于上皮來源的實體瘤。對于EGFR酪氨酸激酶活性的抑制可妨礙腫瘤的生長，轉移和血管生成，并增加腫瘤細胞的凋亡[1]。但目前國內較少見到關于吉非替尼含量測定的報道。本文采用高效液相色譜法，以吉非替尼純品為對照品，測定易瑞沙中吉非替尼的含量。操作簡便、快速、規范，結果準確可靠，可用于含吉非替尼藥物的質量控制。

1 儀器與試藥

島津LC-10ATVP高效液相色譜儀,島津SPV-10AVP可變波長檢測器，N2000在線色譜工作站。KH5200DE型數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；吉非替尼對照品（珠海運城醫藥有限公司，純度：99%）；吉非替尼藥片（實驗室自制，規格：0.125g）；易瑞沙（由英國阿斯利康公司提供，規格：0.25g）；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為雙蒸水。

2 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18(250×4.6mm)；流動相：甲醇：水（80:20，含0.1%的三乙胺）；柱溫：室溫；流速：1 ml/min；檢測波長：330nm；進樣體積：20μl。按以上色譜條件測量得到吉非替尼對照品、吉非替尼供試品（實驗室制）、易瑞沙供試品及陰性樣品色譜圖，見圖1。

圖1 吉非替尼標準品（A）、吉非替尼供試品（實驗室制）（B）、易瑞沙供試品（C）及陰性樣品（D）圖譜Fig1:HPLC chromatograms of gefitinib reference substance(A),sample of gefitinib (laboratory-made) (B),sample of Iressa(C) and sample without gefitinib(D)

3 方法與結果

3.1 樣品溶液的配制

3.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取吉非替尼標準品25mg，置50ml容量瓶中，加入甲醇至刻度，超聲使其溶解，制得濃度為500g/ml的吉非替尼標準溶液，備用。

3.1.2 供試品溶液的制備

3.1.2.1 吉非替尼供試品(實驗室制)溶液的制備

取吉非替尼藥片(實驗室制)10片，精密稱定，得其平均片重為0.5099g，研細，精密稱定吉非替尼藥片粉末（0.5099g）,置100ml容量瓶中,精密加入足量甲醇至刻度,稱定重量,超聲處理15分鐘,冷卻,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,濾過。再精密吸取濾液2ml，置于50ml容量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

3.1.2.2 易瑞沙供試品溶液的制備

取易瑞沙1片，小心刮去薄膜衣，準確稱量。準確稱取約含吉非替尼0.0101g的樣品粉末，置于100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲15min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過即得。

5.由于旋挖機的自重大，應平整場地，清除雜物，換除軟土或鋪墊鋼板，鉆機履帶不宜直接置于不堅實填土上，以防不均勻沉降。

3.1.3 陰性對照液的制備

取片劑處方組成中除吉非替尼的其余輔料成分（乳糖、微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸鎂和聚維酮）制成不含吉非替尼的陰性對照品，按“3.1.2.1”項下的制備方法處理得陰性對照液。

3.2 線性關系的考察

分別精密吸取吉非替尼對照品溶液（濃度為500g/ml）0.2、0.6、1.0、1.6、2.0ml置于10ml容量瓶中,加流動相稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件，分別取20ul注入高效液相色譜儀,以濃度C（g/ml）對應峰面積A進行回歸，得回歸方程：A=3.6365×104C+7.2769×104，求得r值為0.9995。結果表明吉非替尼濃度在10～100g/ml范圍內線性良好。

3.3 精密度試驗

取上述同一批吉非替尼標準品配成標準溶液，每次取20ul,重復進樣5次，分別測得5個峰面積,得出其RSD值為1.55%，表明精密度良好。

3.4 重復性試驗

取同一批樣品6份，照上述方法溶解、測定，得RSD值為0.88%。表明重復性良好。

3.5 加樣回收率試驗

精密稱取同法測定的已知含量為2.5mg的樣品6份,精密加入吉非替尼對照品2.5mg,依法測定,分別計算其回收率，求得平均回收率為103.1%，RSD值為1.53%。

3.6 樣品測定

3.6.1 吉非替尼供試品（實驗室制）含量測定

表1 吉非替尼供試品（實驗室制）含量測定結果

3.6.2 易瑞沙供試品的含量測定

取樣品3份按“3.1.2.2”項下易瑞沙供試品制備法制備，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20ul注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，每一份樣品測定5次，分別記錄峰面積，以外標法計算各組分的含量，并分別求出5次含量測定結果的RSD值。

表2 易瑞沙供試品的含量測定結果Tab 2 Results of Iressa assay

4 討論

4.1 流動相的選擇

實驗對象吉非替尼是極性較大的物質，實驗過程中曾采用甲醇：水（80：20）作為流動相，檢測所得峰存在拖尾現象。隨后在流動相中加入0.1%三乙胺作為掃尾劑，即可改善了峰形。流動相中加入競爭性的胺類——三乙胺(TEA)，TEA可以與硅醇發生強的反應，并抑制樣品中的胺類與硅醇反應，從而達到調整峰形的目的。

4.2 色譜柱的壓力問題

剛開始實驗時，因進樣濃度較高的吉非替尼對照品溶液（1mg/ml），導致用純甲醇沖色譜柱時壓力升至20Mpa左右，接近色譜柱所能承受的最大壓力。對色譜柱進行檢查，發現其中的篩板表面比較渾濁骯臟，于是將篩板置于甲醇中超聲15min后用刷子輕輕刷掉污垢，然后重新給色譜柱裝上。處理過后的色譜柱用純甲醇沖洗時壓力為6Mpa左右，壓力明顯降低，用于測量一切正常。

4.3 三乙胺對色譜柱的影響及解決方案

三乙胺的pKa為11.09，在pH≤9.09的條件下是以離子狀態的形式存在的，因此pH在2.5～8.64時，三乙胺容易與Si－O－形成相對較強的靜電吸引力。這就導致了三乙胺很難被洗脫，逐漸會成為固定相的一部分，從而使保留時間發生較大變化。

據文獻記載，蘇坦[2]通過實驗證明用大量的乙酸溶液（0.1%）和甲醇沖洗色譜柱可以明顯地改善柱效。在本實驗的操作過程中，當進行吉非替尼精密度試驗時，曾出現在相對一致的實驗條件下，所得出的色譜峰峰形差別較大的現象，即后者相對于前者存在較明顯的拖尾現象。因此，綜合參考資料后，先采用10倍柱體積的0.1%乙酸溶液沖洗再用20ml10%甲醇溶液沖洗，最后用20倍柱體積的甲醇復生。在沖洗柱子后進行實驗，觀察所檢測到的色譜峰，拖尾現象基本被消除。在用0.1%乙酸溶液沖洗柱子時，在210nm的檢測波長下（此時三乙胺有較大吸收），出現了兩個峰形相近的色譜峰，據此可猜測沖洗液中的乙酸與色譜柱中殘留的三乙胺結合形成鹽，并被沖洗液中的水洗脫出來。

5 結論

吉非替尼主要是用于非小細胞肺癌的治療，具有非常廣闊的臨床應用前景[3]。有報道顯示用電噴霧器串聯質譜來測定吉非替尼的含量,但該儀器設備較昂貴，這致使有關吉非替尼含量測定的研究受到局限[4]。此外，國內外有關吉非替尼藥物中吉非替尼的含量測定的研究報道較少，證明這一方面研究不足，進而影響到藥品的質量監測和使用。目前國內外對于吉非替尼的藥理作用研究較為深入，因此完善吉非替尼的含量測定方法將有助于提高吉非替尼藥理實驗結果的準確性，增強其說服力，同時也有利于展開關于吉非替尼的各方面研究。

目前已有的關于吉非替尼含測的文獻存在操作不規范等問題，本文采用高效液相色譜法對吉非替尼進行含量測定，操作簡便、快速、規范，結果準確可靠，可用于含吉非替尼相關藥物的質量控制。

[1] 鄭航,陳錦章,羅榮城.吉非替尼治療晚期非小細胞肺癌的臨床研究[J].臨床腫瘤學雜志,2006,11(10):744-746.

[2] 蘇坦.三乙胺對色譜柱的影響及解決方案[J].中國中醫藥咨詢,2010,2(01):109.

[3] 范姍姍,戴紅.吉非替尼治療晚期非小細胞肺癌的研究進展[J].當代醫學，2010,16（6）：20-21.

[4] 鐘延霞,陳艷雪,王寶君.反相高效液相色譜法測定吉非替尼的含量[J].河北師范大學學報,2010,34(04):453-454.