10個(gè)玉米品種間過氧化物同工酶的研究

王世華，高雙成，郝轉(zhuǎn)芳，施 江，付國(guó)占

(1.河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南洛陽(yáng)471003;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京100081)

0 前言

同工酶的形成是生物體基因結(jié)構(gòu)差異造成的，在進(jìn)化過程中有一定的保守性［1］。同工酶是基因和性狀的連接物，具有明顯的種屬、組織和發(fā)育階段的特異性，既是生理指標(biāo)，又是可靠的遺傳標(biāo)志［2］。同工酶技術(shù)，是通過凝膠電泳的方法，將不同的同工酶酶帶分離開，經(jīng)過染色形成酶帶譜，在遺傳育種、生長(zhǎng)發(fā)育、物種起源等領(lǐng)域的成為一種重要的研究工具，也可作為鑒定生物基因型是否有差異的可靠指標(biāo)［3－5］。最早將同工酶應(yīng)用于玉米雜種研究的是Schwartz，他發(fā)現(xiàn)了雜交后代中有新的酶帶表達(dá)(稱為雜交酶)，并試圖把它和雜種優(yōu)勢(shì)聯(lián)系起來(lái)［6］。中國(guó)科技工作者利用非變性不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，研究了過氧化物酶、酯酶等同工酶與玉米雜種優(yōu)勢(shì)的關(guān)系［7－10］，極大地推動(dòng)了同工酶在玉米雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)和優(yōu)良品種選育上的應(yīng)用。目前，國(guó)內(nèi)做同工酶研究的較多，劉正蒙利用酯酶同工酶測(cè)定了25個(gè)玉米自交系的酶譜距離，對(duì)組合間酶譜距離與其籽粒產(chǎn)量雜種優(yōu)勢(shì)進(jìn)行了相關(guān)分析，二者呈顯著相關(guān)［11］。劉新文等通過在玉米不同發(fā)育階段選取不同部位組織樣品，進(jìn)行POD和EST同工酶的電泳分析，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段不同部位組織樣品，其同工酶帶數(shù)與活性是不同的，從而可以將11種多胞質(zhì)系區(qū)分開來(lái)［12］。但研究特用玉米(甜玉米、糯玉米)和普通玉米的親緣關(guān)系還較少，本文用聚丙烯酰胺電泳技術(shù)對(duì)玉米幼苗進(jìn)行了過氧化物同工酶分析，采用計(jì)算聯(lián)合系數(shù)的方法，鑒定了10個(gè)玉米品種間的親緣關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以中國(guó)選育并審定登記的10個(gè)玉米品種為供試材料，其編號(hào)分別為Y1:贛新花糯1號(hào);Y2:豫禾988;Y3:渝彩甜糯1號(hào);Y4:臺(tái)灣超甜38號(hào);Y5:滑玉12;Y6:美糯2號(hào);Y7:張玉9號(hào);Y8:洛陽(yáng)800;Y9:沈單16;Y10:魯單981。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶液制備

取10個(gè)玉米品種的種子各20粒，分別播種于沙床，培養(yǎng)至長(zhǎng)出2片幼葉，每品種分別稱取幼葉各0.1 g，加0.3 mL提取液(0.2 mol/L的PBS，pH 7.0)，置冰浴中研磨至勻漿，4℃、10 000 r/min離心15 min，取上清液置－4℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 制膠及電泳

制膠時(shí)所用的分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%(pH 8.9)，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%(pH 6.8)。電極緩沖液為Tris-Gly系統(tǒng)(pH 8.3)，指示劑為溴酚藍(lán)，點(diǎn)樣量為30μL，開始穩(wěn)壓100～150 V，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠和濃縮膠交界處時(shí)，電壓加大到200～250 V，低溫電泳約4 h。

1.2.3 染色

過氧化物同工酶染色液［13］:5 mL的2%聯(lián)苯胺醋酸溶液(2 g聯(lián)苯胺溶于18 mL冰乙酸中，加水72 mL)和2 mL的3%H2O2，加蒸餾水93 mL。

電泳完畢取下凝膠置于染色液中染色5～10 min，待酶帶清晰可見后用蒸餾水漂洗后觀察結(jié)果并照相記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 10個(gè)玉米品種間過氧化物同工酶分析

按相對(duì)遷移率Rf值繪制模式圖并標(biāo)定酶帶位置。Rf=酶帶移動(dòng)的距離/前沿指示劑(溴酚藍(lán))移動(dòng)的距離。經(jīng)電泳分析供試的10個(gè)玉米品種的過氧化物同工酶酶譜可以歸為若干酶譜類型，將所有的酶譜排在一起，總共分離出36條酶帶，按其電泳遷移率(Rf)集中程度由負(fù)極向正極可分為A、B、C三個(gè)區(qū)，各品種的過氧化物同工酶酶帶數(shù)為2～ 6條，遷移率在0.075～0.457之間變化(見圖1)。其中，A區(qū)為近陰極端的慢速遷移區(qū)，Rf=0.075;B區(qū)為中速遷移區(qū)，Rf=0.161～0.226;C區(qū)為近陽(yáng)極端的快速遷移區(qū)，Rf=0.441～0.457。從10個(gè)品種間酶帶來(lái)看，Y1、Y2、Y5和Y7的酶帶大致相同，都只有3條帶，位置相同，但酶帶活性各異。Y3和Y6的酶帶數(shù)相同，位置也一樣，酶帶活性有差別。酶帶數(shù)最多的品種是Y8和Y9，都是6條酶帶，酶帶位置都相同，僅在活性方面有差別。酶帶數(shù)最少的是Y4和Y10，均只有2條酶帶。

圖1 玉米10個(gè)品種間過氧化物同工酶模式圖

從表1可知:10個(gè)玉米品種間過氧化物同工酶酶譜也具有一定的差異，主要表現(xiàn)在酶帶數(shù)、酶帶遷移率與酶活性上面。A、B、C三個(gè)區(qū)都有各自的公共帶，其中A區(qū)的公共帶Rf=0.075，B區(qū)的公共帶Rf=0.161，C區(qū)的公共帶Rf=0.441。

表1 玉米10個(gè)品種間過氧化物同工酶相對(duì)遷移率(Rf)

2.2 10個(gè)玉米品種間親緣關(guān)系的分析

玉米品種間親緣關(guān)系的分析主要是通過任何兩個(gè)玉米品種間聯(lián)合系數(shù)(S)的比較得出，聯(lián)合系數(shù)的數(shù)值大小直接反映出親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。根據(jù)任何2個(gè)品種同工酶酶譜的條帶估算，可得出任何2個(gè)玉米品種之間的聯(lián)合系數(shù)(S)［14］。S=(兩個(gè)品種之間共有的酶帶)/［(兩個(gè)品種所具有的酶帶數(shù)之和)－(共有的酶帶數(shù))］，聯(lián)合系數(shù)在0～1之間，聯(lián)合系數(shù)愈小，說明兩個(gè)品種間親緣關(guān)系愈遠(yuǎn)。

從表2可看出:Y4和Y8、Y9之間以及Y10和Y8、Y9之間過氧化物同工酶的聯(lián)合系數(shù)(S)都最小，均為0.333，說明它們的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

Y1和Y2、Y5、Y7之間過氧化物酶同工酶的聯(lián)合系數(shù)為1.000，說明它們之間的親緣關(guān)系較近;Y4和Y10之間過氧化物酶同工酶的聯(lián)合系數(shù)為1.000，說明它們的親緣關(guān)系較近;Y8和Y9之間的過氧化物酶同工酶的聯(lián)合系數(shù)也為1.000，可見二者的親緣關(guān)系也十分相近。其余品種的親緣關(guān)系，通過過氧化物酶同工酶的聯(lián)合系數(shù)得出，聯(lián)合系數(shù)越小，品種間的差異越大，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。

表2 玉米10個(gè)品種間過氧化物酶同工酶的聯(lián)合系數(shù)(S)

3 結(jié)論

通過對(duì)10個(gè)玉米品種的過氧化物同工酶酶譜分析，總共分離出36條酶帶，按其電泳遷移率(Rf)集中程度由負(fù)極向正極可分為A、B、C三個(gè)區(qū)。其中，A區(qū)的公共帶Rf=0.075;B區(qū)的公共帶Rf=0.161; C區(qū)的公共帶Rf=0.441。各品種的過氧化物同工酶酶帶數(shù)為2～6條，遷移率在0.075～0.457之間變化。對(duì)10個(gè)玉米品種親緣關(guān)系進(jìn)行分析，并研究它們的遺傳相似程度，研究發(fā)現(xiàn)臺(tái)灣超甜38號(hào)與洛陽(yáng)800、沈單16的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，而滑玉12與張玉9號(hào)的親緣關(guān)系比較近，洛陽(yáng)800與沈單16具有非常近的親緣關(guān)系。

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