正交試驗(yàn)法優(yōu)選連翹葉中連翹酯苷A的提取工藝

靖 會(huì)，李教社，楊銀京

(1.西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 西安 710021；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710061)

連翹為木犀科植物連翹 Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果實(shí)，有清熱解毒、散結(jié)消腫功效，臨床上多用于治療呼吸道感染、急性腎炎、肝炎、腦膜炎等疾病。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，連翹中的主要活性成分連翹酯苷A具有很強(qiáng)的抗菌[1]、抗病毒[2]、抑制彈性蛋白酶活力[3]以及清除活性氧[4]等作用。文獻(xiàn)[5]以及前期試驗(yàn)研究表明，連翹葉中連翹酯苷A含量較高，可高達(dá)6%。為更好地開發(fā)利用這一中藥材，擴(kuò)大藥用資源，筆者對(duì)連翹葉中連翹酯苷A的提取工藝進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

TSP 2000型高效液相色譜儀，UV100型紫外檢測(cè)器，AE240型電子分析天平(梅特勒－托利多儀器有限公司)。連翹葉采自陜西省黃龍縣，經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院郭增軍副教授鑒定為木犀科植物連翹 Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥葉。連翹酯苷A對(duì)照品(自制，經(jīng)核磁共振、質(zhì)譜鑒定，歸一化法測(cè)定其質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%)；乙腈為色譜純；水為三蒸水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 連翹酯苷A含量測(cè)定(高效液相色譜法)[6]

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Tianhe C18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈－水－醋酸(15∶85∶0.2)；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：332 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μL。

2.1.2 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密稱取連翹酯苷A對(duì)照品適量，用50%甲醇溶液配成0.810g/L的對(duì)照品貯備液。精密吸取對(duì)照品貯備液5mL，置10mL量瓶中，并用50%甲醇溶液定容至刻度，得質(zhì)量濃度為0.405g/L的對(duì)照品溶液，依次稀釋得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣20μL，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度(g/L)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=1 038 545.97X－7 923.47，r=0.999 9。結(jié)果表明，連翹酯苷質(zhì)量濃度在0.010～0.810g/L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為0.50%(n=5)。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，1，2，4，6，8，10，12，24 h時(shí)進(jìn)樣。結(jié)果的 RSD為1.80%(n=9)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：于含連翹酯苷A分別為0.353，0.351，0.348，0.346，0.354g/L的供試品溶液中各精密加入連翹酯苷A對(duì)照品0.358mg，依法測(cè)定連翹酯苷A的含量。計(jì)算得平均回收率為100.5%，RSD為1.61%(n=5)。

2.1.3 樣品含量測(cè)定

取樣品粉末(80目)約0.1g，置25mL量瓶中，精密稱定，加入50%甲醇溶液20mL，超聲1 h，取出，放冷至室溫，加50%甲醇溶液至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，濾液進(jìn)樣20μL。用外標(biāo)法計(jì)算藥材中連翹酯苷A的含量。結(jié)果本批藥材中含連翹酯苷A為6.95%(n=5)。

2.2 提取工藝優(yōu)選

2.2.1 單因素考察

提取溶劑：精密稱取連翹葉粗粉5份，各0.1g，置圓底燒瓶中，分別加入10%，30%，50%，70%，95%的乙醇25mL，稱定質(zhì)量，水浴回流2 h，放冷，用溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，測(cè)定連翹酯苷A的含量，計(jì)算提取率。結(jié)果提取率分別為75.68%，92.09%，96.40%，83.45%，70.22%，表明以50%乙醇為提取溶劑時(shí)提取率最高。

提取方法：稱取連翹葉粗粉10g，加50%乙醇100 mL，浸泡24 h，抽濾，濾液保留，藥渣再同法冷浸2次，合并濾液。取同量連翹葉粗粉，加50%乙醇100mL，加熱回流2 h，抽濾，濾液保留，藥渣再同法加熱回流2次，合并濾液。取同量連翹葉粗粉，加50%乙醇潤(rùn)濕后，裝入滲濾筒中，浸泡24 h，滲濾，收集300mL滲濾液。取不同提取方法得到的提取液，測(cè)定連翹酯苷A的含量，計(jì)算提取率。結(jié)果冷浸法、回流法、滲濾法3種方法的提取率分別為85.4%，87.4%，89.3%，表明以滲濾法提取率較高。

滲濾溶劑倍數(shù)：稱取連翹葉粗粉10g，加入50%乙醇潤(rùn)濕，裝入滲濾筒中，浸泡24 h，以0.5mL/min的速率滲濾，收集滲濾液。當(dāng)滲濾溶劑為2，4，6，8，10，12倍時(shí)，精密吸取滲濾液1mL，稀釋后測(cè)定連翹酯苷A的含量，計(jì)算提取率，結(jié)果分別為35.52%，65.30%，82.87%，84.95%，85.25%，85.30%，表明加入8倍量以上溶劑時(shí)提取率增加不顯著。

2.2.2 正交試驗(yàn)[7]

為了對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定浸漬時(shí)間(因素A)、滲濾速率(因素B)、滲濾體積(因素C)3個(gè)因素，用L9(34)正交表安排試驗(yàn)，因素水平見表1。每次試驗(yàn)稱取連翹葉粗粉10g，以連翹酯苷A的提取率為考察指標(biāo)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2，方差分析見表3。直觀分析表明，以連翹酯苷A的提取率為指標(biāo)，較好的搭配方案為A3B1C3，即浸漬時(shí)間為24 h，滲濾速率為0.5 mL/min，滲濾體積8倍量。極差R大小為A＞B＞C，說明浸漬時(shí)間對(duì)連翹酯苷A的提取率影響最大，其次為滲濾速率。方差分析表明，以連翹酯苷A的提取率為指標(biāo)，3個(gè)因素均有顯著影響。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)數(shù)據(jù)

表3 方差分析表

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按正交試驗(yàn)確定的最佳工藝，將連翹葉粉碎成粗粉，用50%乙醇浸潤(rùn)，裝入滲濾桶中，浸泡24 h。用50%乙醇以0.5mL/min的速率滲濾，收集8倍量滲濾液。測(cè)定提取液中連翹酯苷A的含量，計(jì)算得提取率為88.1%，RSD=1.1%(n=4)。

3 討論

連翹酯苷A為強(qiáng)極性化合物，易溶于水、含水乙醇、含水甲醇，根據(jù)工業(yè)化生產(chǎn)的可行性和安全性考慮，對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇作為提取溶劑進(jìn)行了考察，以確定最佳提取溶劑。連翹酯苷A為一含多個(gè)酚羥基的苷類化合物，不穩(wěn)定，溫度過高易引起氧化或水解，因此提取分離過程中應(yīng)盡量采用低溫。試驗(yàn)中將冷浸法、回流法、滲濾法3種提取方法相比較，滲濾法不僅提取率較高，而且工藝簡(jiǎn)單，不需加熱，節(jié)省能源，故選擇滲濾法為提取方法進(jìn)行工藝考察。在含量測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，藥材粉碎度越大，提取率越高，但考慮到工藝采用滲濾的方法和特點(diǎn)，藥粉越細(xì)，滲濾速率越慢，故試驗(yàn)中采用粗粉進(jìn)行滲濾。

[1]匡海學(xué)，張 寧，陸志博.青連翹抗菌活性成分的研究[J].中藥通報(bào)，1988，13(7)：32.

[2]胡克杰，徐凱建，王 棟，等.連翹酯甙體外抗病毒作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥研究，2001，8(2)：89.

[3]張立偉，趙春貴，王進(jìn)東，等.連翹酯甙分離提取及抑制彈性蛋白酶活性研究[J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2002，14(2)：219.

[4]劉 金，張立偉.連翹酯苷對(duì)·OH引發(fā)的DNA損傷的防護(hù)作用[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，7(1)：23.

[5]曲歡歡，翟西峰，李白雪，等.連翹不同部位中連翹酯苷和連翹苷的含量分析[J].藥物分析雜志，2008，28(3)：382.

[6]靖 會(huì)，李教社，曹 蔚，等.高效液相色譜法測(cè)定連翹中連翹酯苷的含量[J].西北藥學(xué)雜志，2003，18(4)：156.

[7]鄭翠英，夏艷姣，徐超群.白芷中香豆素類成分的提取[J].華西藥學(xué)雜志，2008，23(6)：683－684.