黃鱔IRF-1和IRF-2保守序列的克隆與表達

顧琬雯，許巧情，宋 浪，李昊成，袁漢文 （長江大學動物科學學院，湖北荊州434025）

郝立平（湖北信息工程學校，湖北 荊門448124）

干擾素家族 （interferons，IFNs）是具有一系列多種功能的細胞因子，它們在抵抗病毒、調節細胞生長和調控免疫反應方面起著重要的作用。干擾素調節因子 （Interferon regulatory factors，IRFs）是在研究干擾素轉錄調控時發現的。迄今為止，在脊椎動物中共發現10種干擾素調節因子，即IRF-1～IRF-10。它們的主要作用是調節干擾素和干擾素誘導基因的表達[1]。此外，IRFs在造血細胞分化、免疫基因的調節中也發揮重要的作用[2]，同時IRFs還參與Toll-like信號通路和其他的模式識別受體的免疫反應[3]。

魚類作為一類非常重要的脊椎動物，對其免疫基因的研究有助于闡明其免疫機理和功能。目前，在魚類中已經報道了幾種IRFs的基因組結構和表達。例如IRF-1在虹鱒 （Oncorhynchusmykiss）[4]、大菱鲆 （Scophthalmusmaximus）[5]、鱖 （Sinipercachuatsi）[6]，IRF-2 在虹鱒[4]和 鱖[7]，IRF-3 在虹鱒[8]，IRF-6在斑馬魚 （Daniorerio）[9]，IRF-7在鱖[6]、虹鱒[8]和大西洋鮭 （Salmosalar）[10]中均有報道。而IRF-1和IRF-2在黃鱔 （Monopterusalbus）中尚未見任何報道。黃鱔集約化養殖程度大、種質資源退化、養殖水環境惡化，其病害的發生率愈來愈高，嚴重制約著黃鱔養殖業的發展，而加強對黃鱔免疫因子的研究可為黃鱔的疾病防治提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

受試黃鱔來自長江大學黃鱔養殖基地，體重約100g，在實驗室暫養2～3d后用于試驗。

1.2 黃鱔RNA的提取及反轉錄

取新鮮的脾臟、中腎、腸等混合組織共100mg，迅速加入Trizol，冰上放置或冷凍于-80℃中。使用Trizol?Reagents提取黃鱔組織總RNA。然后參照Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit的方法合成cDNA，分裝保存于-20℃中。

1.3 黃鱔IRF-1和IRF-2cDNA中間序列的擴增

根據 NCBI上的鱖 （登錄號為 AY647431.1）、大黃魚 （Larimichthyscrocea，登錄號為GU175707.2）、斜帶石斑魚 （Epinepheluscoioides，登錄號為 GU988700.1）和大西洋鮭 （Salmosalar，登錄號為CBL58209.1）IRF-1cDNA序列的保守部分設計簡并引物IRF-1-F1和IRF-1-R1，擴增黃鱔IRF-1cDNA的中間序列 （登錄號為JN695589）（表1）；根據NCBI上的牙鲆 （Paralichthysolivaceus，登錄號為JF312911.1）、虹鱒 （登錄號為 NM ＿001124438.1）和斜帶石斑魚 （登錄號為FJ828965.1）IRF-2cDNA序列的保守部分設計簡并引物IRF-2-F1和IRF-2-R1，擴增黃鱔IRF-2cDNA的中間序列 （登錄號為JN695590）（表1）。

表1 擴增IRF-1／IRF-2cDNA序列以及表達所用的引物

1.4 系統進化樹的構建

利用NCBI上已有的蛋白序列和黃鱔4種IRFs蛋白序列構建系統進化樹，各個物種蛋白序列的登錄號見表2。進化樹采用MEGA 4.0構建。

1.5 黃鱔不同組織和不同發育階段IRF-1和IRF-2的表達

1.5.1 RNA的提取

在長江大學黃鱔養殖基地選取3個發育階段 （雌性、間性和雄性）的黃鱔各3尾，在實驗室暫養1周后分別取雌鱔、間性黃鱔、雄鱔的中腎和脾臟組織，迅速加入Trizol，冰上放置，使用Trizol?Reagents提取黃鱔組織總RNA，方法同1.2所述，所得樣本作為研究不同發育階段表達之用。取3尾暫養1周后的雄鱔，分別取其新鮮的性腺、肌肉、血液、皮膚、腸、中腎、脾臟、肝臟 腦各100mg，迅速加入Trizol，冰上放置，使用Trizol?Reagents提取黃鱔組織總RNA，方法也同1.2所述，所得樣本作為研究不同組織表達之用。

1.5.2 RNA樣品中DNA的處理

取2μl溶于DEPC水的RNA，1μl在紫外分光光度計上測出RNA樣品的濃度，1μl進行電泳，根據所測RNA的濃度和電泳結果，取2μl總RNA用進行DNase I處理。反應體系為：RNA 2μg，10×DNase I Buffer 2μl，DNase I（RNase-free，1U／μl，Fermentas）2μl，RNase Inhibitor（40U／μl，Fermentas）1μl，DEPC-treated H2O直至20μl。將反應液短暫離心以混勻，PCR儀上37℃運行30min。然后向離心管加入1μl 25mmol／L EDTA處理65℃，然后立即置于冰上或者-80℃凍存。

1.5.3 cDNA模板的準備

參照Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit的方法合成cDNA，分裝保存于-20℃中。

1.5.4 β-actin、IRF-1和IRF-2基因的擴增

利用已測序驗證的IRF-1、IRF-2中間序列設計特異引物IRF-1-RT-F2、IRF-1-RT-R2和IRF-2-RT-F2、IRF-2-RT-R2，利用黃鱔β-actin基因 （登錄號為AY345056.1）設計引物β-actin F和β-actin R。

分別采用β-actin F／β-actin R、IRF-1-RT-F2／IRF-1-RT-R2和IRF-2-RT-F2／IRF-2-RT-R2引物對上述9個組織或3個不同發育階段的中腎和脾臟cDNA模板進行擴增。取β-actin PCR產物電泳，根據9個組織或不同發育階段的中腎和脾臟電泳條帶強弱調節PCR擴增后的模板加入體積，直至9個組織或不同發育階段的中腎和脾臟6個樣本的β-actin基因擴增條帶亮度基本一致。按照同樣體積的模板量進行IRF-1和IRF-2的電泳，揭示黃鱔不同發育階段或不同組織IRF-1和IRF-2基因的表達情況。β-actin擴增程序為：95℃變性5min；94℃30s，56℃20s，72℃20s，運行25個循環；72℃延伸10min；IRF-1和IRF-2擴增程序均為：94℃ 變性5min；94℃30s，54℃30s，72℃30s，運行35個循環。

2 結果與分析

2.1 黃鱔IRF-1和IRF-2保守序列及分析

已擴增到的IRF-1cDNA長507bp（GenBank登錄號：JN695589），編碼168aa（圖1）。IRF-2cDNA長794bp（GenBank登錄號：JN695590），編碼264aa（圖2）。

圖1 黃鱔IRF-1的核酸序列和推斷的氨基酸序列 （登錄號為JN695589）

圖2 黃鱔IRF-2的核酸序列和推斷的氨基酸序列 （登錄號為JN695590）

利用NCBI上已有的蛋白序列和黃鱔4種IRFs蛋白序列，采用MEGA 4.0構建系統進化樹，結果如圖3。從圖3可以看出，各種脊椎動物的IRF-2聚集在一起，成為一束，黃鱔IRF-2（MaIRF2）與斜帶石斑魚IRF-2（EcIRF2）最為接近；黃鱔IRF-1（MaIRF1）與鱖 （ScIRF1）和大黃魚 （LcIRF1）最為接近，它們與大西洋鮭 （SsIRF1）和草魚 （CiIRF1）聚集在一起，形成一大束，但斑馬魚IRF-1（DrIRF1）卻與其他魚類的IRF-1相距較遠，而與所有生物的IRF-1和IRF-2聚合在一起，這說明從進化上講IRF-1和IRF-2親緣關系較近。

2.2 黃鱔不同發育階段IRF-1和IRF-2的表達

IRF-1-RT-F2／IRF-1-RT-R2在黃鱔cDNA上擴增的片段大小為507bp，β-actin F／β-actin R擴增的片段長度為397bp（圖4A）。從圖4A可以看出，黃鱔3個不同的發育階段即雌性、間性和雄性的中腎和脾臟組織IRF-1的表達量基本一致，無明顯的差別。

IRF-2-RT-F2／IRF-2-RT-R2在黃鱔cDNA上擴增的片段大小為577bp，F／β-actin R擴增的片段長度為398bp（圖4B）。圖4B顯示，黃鱔3個不同的發育階段即雌性、間性和雄性的中腎和脾臟組織IRF-2的表達量基本一致，無明顯的差別。

2.3 黃鱔不同組織IRF-1和IRF-2的表達

黃鱔性腺、肌肉、血液、皮膚、腸、中腎、脾臟、肝臟和腦等組織IRF-1和IRF-2的表達情況見圖5，其中IRF-1血液、皮膚、腸、中腎和肝臟有明顯清晰的條帶，說明在這5種組織中表達量較高，其次為性腺、脾臟和腦，而肌肉中表達量很弱，基本看不到條帶 （圖5A）。中腎的IRF-2條帶最清晰，說明IRF-2的表達量最高，其次為腸和脾臟，肝臟、腦、血液、皮膚和性腺IRF-2表達很弱，肌肉中基本看不到明顯的擴增條帶，說明IRF-2在肌肉中表達量很低 （圖5B）。

3 討論

圖3 黃鱔IRF-1和IRF-2與其他脊椎動物IRF-1和IRF-2的進化關系

圖4 黃鱔不同發育階段IRF-1（A）和IRF-2（B）的表達

干擾素調節因子是調節干擾素以及干擾素相關基因的轉錄因子[11]。它們在結構特征上具有保守的序列特征，所有成員前115個氨基酸同源性較高，具有4～6個保守間隔排列的色氨酸，具有螺旋-轉角-螺旋的DNA結合結構域 （DNA binding domain，DBD）[3]。IRF-1是發現的第一個能在體外激活I型干擾素的干擾素調節因子，最初研究表明：IRF-1能夠結合到IFN-β啟動子區域的正向調節區I，對IFN-β的轉錄起促進作用[12]。但進一步研究表明，在病毒激活的細胞質I型干擾素產生的通路中并不一定要IRF-1的介導[13]。IRF-2通常被認為是一個轉錄抑制因子，對IRF-1起著拮抗的作用。IRF-2結合干擾素或干擾素誘導基因的ISRE序列的能力是IRF-1的數十倍，從而一直這些基因的表達[14]。

圖5 黃鱔不同組織IRF-1（A）和IRF-2（B）的表達

魚類IRF-1最早是在牙鲆 （Paralichthysolivaceus）發現的[15]。從牙鲆cDNA文庫中篩選出一個長1746bp的序列，當時命名為fIRF，fIRF與已報道的鳥和哺乳動物的IRF-1和IRF-2相似性達40%。而且，fIRF的DNA結合域具有IRF家族最典型的5個色氨酸殘基。隨后，在其他魚類中開展了大量的研究。利用細胞巨化病毒介導的增強子構建的牙鲆IRF-1重組質粒，在同源細胞系中用轉染試驗研究牙鲆抗病毒機制，結果表明牙鲆IRF-1通過產生類似于細胞因子的產物來誘導細胞發揮抗病毒作用[16-17]。同時，過量表達的IRF-1能調控IFN以及ISG基因的表達[18]。為了研究IRF-1的抗病毒機理，亞細胞定位揭示鯽IRF-1有2個核定位信號，它們均能促使IRF-1從細胞質轉移至細胞核中，這就充分地闡明了魚類IRF-1在病毒感染前后的遷移規律。此外，還有學者對魚類IRF-1和IRF-2基因的啟動子活性進行了研究。以虹鱒IRF-1A啟動子構建的魚類特異性表達載體pIRF-1A-G，作為DNA疫苗免疫虹鱒后，能在體內成功表達IHNV的G蛋白，使魚體獲得免疫保護反應[19]；Collet等[20]將虹鱒IRF-2基因上游啟動子克隆到報道基因載體pGL3-basic中，通過轉染細胞、熒光素酶活性測定試驗證明IRF-2基因上游啟動子具有較強的啟動子活性，這些都將有助于進一步闡明IRF-1和IRF-2的功能。

IRF-1和IRF-2的表達規律已有許多相關報道。在其他魚類中，IRF-1和IRF-2廣泛地表達于各種組織或器官[5，6，21，22]，呈現組成型表達。本研究表明IRF-1和IRF-2在黃鱔3個不同發育階段表達規律基本一致，而在檢測的9種組織中IRF-1血液、皮膚、腸、中腎和肝臟表達量較高，而IRF-2在中腎、腸和脾臟中表達量較高，這與大黃魚[23]、斜帶石斑魚[21]、鱖[6]的表達規律基本一致，但與牙鲆[15]、虹鱒[4]和紅鰭東方鲀 （Fugurubripes）[24]存在一定差異，這可能是不同的魚類生長的環境不同造成的。此外，IRF-1和IRF-2在誘導后表達量會顯著上升。牙鲆在輪狀病毒（rotavirus）和遲鈍愛得華氏菌 （Edwardsiellatarda）免疫后，IRF-1mRNA表達量均得到上調[15]；虹鱒IRF-1用Poly I：C腹腔注射虹鱒后，鰓、頭腎、肝臟和脾臟中IRF-1表達量均明顯上升[4]；Poly I：C能鱖魚誘導IRF-2的表達[7]。這些說明IRF-1和IRF-2在魚類抵抗病原菌的防御中起著十分重要的作用。

[1]Mamane Y，Heylbroeck C，Genin P，et al.Interferon regulatory factors：the next generation [J].Gene，1999，237：1-14.

[2]Colonna M.TLR pathways and IFN-regulatory factors：to each its own [J].Eur J Immunol，2007，37：306-309.

[3]Tamura T，Yanai H，Savitsky D，et al.The IRF family transcription factors in immunity and oncogenesis [J].Annu Rev Immunol，2008，26：535-584.

[4]Collet B，Hovens G C，Mazzoni D，et al.Cloning and expression analysis of rainbow troutOncorhynchusmykissinterferon regulatory factor 1and 2（IRF-1and IRF-2）[J].Dev Comp Immunol，2003，27：111-126.

[5]Ordas M C，Abollo E，Costa M M，et al.Molecular cloning and expression analysis of interferon regulatory factor-1（IRF-1）of turbot and sea bream [J].Mol Immunol，2006，43：882-890.

[6]Sun B J，Chang M X，Song Y，et al.Gene structure and transcription of IRF-1and IRF-7in the mandarin fishSinipercachuatsi[J].Vet Immunol Immunopathol，2007，116：26-36.

[7]Sun B，Chang M，Chen D，et al.Gene structure and transcription of IRF-2in the mandarin fishSinipercachuatsiwith the finding of alternative transcripts and microsatellite in the coding region [J].Immunogenetics，2006，58：774-784.

[8]Holland J W，Bird S，Williamson B，et al.Molecular characterization of IRF-3and IRF-7in rainbow trout，Oncorhynchusmykiss：functional analysis and transcriptional modulation [J].Mol Immunol，2008，46：269-285.

[9]Ben J，Jabs E W，Chong S S.Genomic，cDNA and embryonic expression analysis of zebrafish IRF-6，the gene mutated in the human oral clefting disorders Van der Woude and popliteal pterygium syndromes [J].Gene Expr Patterns，2005，5：629-638.

[10]Kileng O，Bergan V，Workenhe S T，et al.Structural and functional studies of an IRF-7-like gene fromAtlanticsalmon[J].Dev Comp Immunol，2009，33：18-27.

[11]Huang B，Qi Z T，Xu Z，et al.Global characterization of interferon regulatory factor（IRF）genes in vertebrates：Glimpse of the diversification in evolution [J].BMC Immunol，2010，11：22.

[12]Escalante C R，Yie J，Thanos D，et al.Structure of IRF-1with bound DNA reveals determinants of interferon regulation [J].Nature，1998，391：103-106.

[13]Matsuyama T，Kimura T，Kitagawa M，et al.Targeted disruption of IRF-1or IRF-2results in abnormal type I IFN gene induction and aberrant lymphocyte development [J].Cell，1993，75：83-97.

[14]Sato M，Taniguchi T，Tanaka N.The interferon system and interferon regulatory factor transcription factors-studies from gene knockout mice [J].Cytokine Growth Factor Rev，2001，12：133-142.

[15]Yabu T，Hirose H，Hirono I，et al.Molecular cloning of a novel interferon regulatory factor in Japanese flounder，Paralichthys olivaceus[J].Mol Mar Biol Biotechnol，1998，7：138-144.

[16]Caipang C M，Hirono I，Aoki T.Induction of antiviral state in fish cells by Japanese flounder，Paralichthysolivaceus，interferon regulatory factor-1 [J].Fish Shellfish Immunol，2005，19：79-91.

[17]Caipang C M，Hirono I，Aoki T.Modulation of the early immune response against viruses by a teleostean interferon regulatory factor-1（IRF-1）[J].Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol，2009，152：440-446.

[18]史 燕，趙 哲，張義兵，等.鯽魚干擾素調節因子1功能初步研究 [J].水生生物學報，2008，32（4）：509-514.

[19]Alonso M，Johnson M，Simon B，et al.A fish specific expression vector containing the interferon regulatory factor 1A （IRF1A）promoter for genetic immunization of fish [J].Vaccine，2003，21 （15）：103-109.

[20]Collet B，McDonald C，Sombes C J.The promoter for the Interferon Regulatory Factor（IRF）-2in the rainbow troutOncorhynchus mykiss：cloning and reporter gene activity [J].Fish Shellfish Immunol，2003b，15：473-477.

[21]Shi Y，Zhu X P，Yin J K，Zhang Q Y，Gui J F.Identification and characterization of interferon regulatory factor-1from orangespotted grouper（Epinepheluscoioides）[J].Molecular Biology Reports，2010，37：1483-1493.

[22]張 躍，白俊杰，李英華，等.牙鲆干擾素調節因子核心區序列的克隆及初步表達 [J].中國水產科學，2001，8（2）：10-13.

[23]Yao CL，Kong P，Huang X N，et al.Molecular cloning and expression of IRF1in large yellow croaker，Pseudosciaenacrocea[J].Fish Shellfish Immunol.2010，28 （4）：654-660.

[24]Richardson M P，Tay B H，Goh B Y，et al.Molecular cloning and genomic structure of a gene encoding interferon regulatory factor in the pufferfish（Fugurubripes）[J].Mar Biotechnol（NY），2001，3：145-151.