EDTA-K 2抗凝末梢血不同檢測時間對血小板計數結果的影響

梁委軍，董家書

（廣西醫科大學第四附屬醫院柳州市工人醫院檢驗科，廣西 柳州 545005）

國際血液學標準委員會(ICSH)推薦使用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)作為血細胞分析的抗凝劑廣泛使用于各個醫院，我們在實際工作中發現一些標本在采集樣本混勻后立即檢測血小板計數結果假性減少，低于100 g/L，而在混勻后再次檢測結果又在正常范圍內，為探討其假性減少原因及采取解決對策，我們對2010年6月至2011年5月收集的62例標本進行采樣混勻后分別進行即時檢測、2 min檢測、5 min檢測、10 min檢測，15～30 min檢測，同時以手工計數法為參照，評估儀器法在采血后不同時間檢測血小板計數的準確性，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料 ①儀器及試劑Sysmex XS-800I血液分析儀，試劑為Sysmex配套產品，定期參加衛生部臨檢中心及區臨檢中心室間質評，每日檢測之前儀器常規保養，本底計數正常，低、中兩個批號的質控品檢測在控；EDTA-K2抗凝管，江蘇康健醫療用品有限公司生產；一次性采血管，規格100μl，山東省成武縣醫用制品廠；手工法血小板稀釋液(草酸銨液)，參照《全國臨床檢驗操作規程》[1]第3版配制。②樣本62例末梢血標本來自門診病人，年齡7個月～76歲，男30例，女32例。

1.2 方法 用75%酒精消毒患者無名指，用一次性采血針刺破皮膚，拭去第一滴血后分別用一次性采血管(規格20 μl，100 μl)采集20 μl、滿管血樣分別置于0.38 ml手工血小板稀釋液中和EDTA-K2抗凝微管中并混勻，用XS-800I血細胞分析儀對經EDTA-K2抗凝并混勻的末梢血標本進行即時檢測、2 min檢測、5 min檢測、10 min檢測、15～30 min檢測，分析血小板計數結果；手工計數方法嚴格參照《全國臨床檢驗操作規程》第3版進行，于30 min內完成，將儀器法計數結果與手工計數結果比較。

1.3 統計學方法 取各組參數的均數作統計學分析，以均數±標準差(±s)表示，采用方差分析，SPSS11.5統計學軟件進行數據處理。

2 結果

EDTA-K2抗凝末梢血不同檢測時間血小板計數結果分別為：即時檢測(142.71±57.45)×109；2 min檢測(206.65±78.04)×109；5 min檢測(203.08±82.52)×109；10 min檢測(211.56±68.85)×109；15～30 min檢測(200.66±70.20)×109；手工計數結果為(211.35±80.36)×109；經方差分析，即時組與其他不同時間組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)，與手工計數比較，差異有統計學意義(P＜0.01)；其他不同時間組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)，與手工計數比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

血細胞分析儀計數血小板具有快速、簡便、重復性好等優點，然而由于血小板易于粘附、聚集、破壞等諸多因素，導致血細胞分析儀測定血小板時常會出現假性減少，血小板可逆聚集[2]就是其中的一種，如不注意，易誘導臨床誤診誤治，甚至引起醫療糾紛。本文數據表明，采血混勻后立即經XS-800I血液分析儀測定，血小板計數結果明顯偏低，與手工計數法及其他時間檢測的結果比較差異有統計學意義(P＜0.01)，分析原因：可能與血小板可逆聚集體的形成有關。當血管壁受損后，會暴露出管壁的內皮表面，內皮細胞表面表達的活性物質和分泌釋放入血的活性成分迅即激活血小板，使活化的血小板表面糖蛋白成分、含量和構象都發生了變化，由靜息狀態的圓盤狀轉變成骨架蛋白滑動后出現的多角形或多偽足形活化狀態[3]，誘導血小板聚集，這種由組織釋放的二磷酸腺苷(ADP)引起的第一時相為可逆性聚集；再者，新鮮末梢血離體后加入到EDTA-K2抗凝管中時，一定濃度的EDTA-K2絡合了血液中的鈣，在接觸血液后瞬間完全溶解，導致抗凝管內壁周圍全血的外環境及溫度發生改變，血小板一旦與經過特殊處理的抗凝管內壁等非血管內膜表面接觸，即迅速擴展，顆粒向中央集中，血小板外膜形成的微小管游離端向外伸展，或因機動蛋白纖維絲向中心方向延長時遇到阻力而產生膜外方向的反作用推力，從而在血小板周圍形成多個絲狀偽足，使血小板形態發生變化，由正常兩面微凸的圓盤狀變為扁平伸展形，并出現明顯的胞漿突起使細胞變成有不規則“偽足”狀外突的樹突型血小板，數個偽足相互纏繞形成血小板聚集體[4]。

分析儀檢測血小板時以電阻脈沖形式計入，采血后立即檢測由于血小板發生聚集，其可逆聚集體不被溶血劑溶解，聚集體所產生的脈沖大于儀器預設的血小板脈沖值，血小板不被計入其結果內或誤把一堆血小板計數成一個血小板，導致血小板數量暫時假性減少。鐘素萍等[5]曾報道，血標本在采集后0.5 min檢測，血小板(PLT)計數值與手工計數差異顯著。由于樹突型血小板及時消除其刺激因素還能變成循環型血小板，采血過程中形成的血小板聚集體由于脫離了創傷面與抗凝劑結合，并經操作者反復振蕩，通過振蕩這種物理作用，打散了血小板與血小板之間的粘附，使血小板聚集團松散進而解聚，大團塊變成幾個小團塊甚至瓦解，釋放粘附其中的血小板。汪兆亮等[6]報道末梢血混勻程度與靜置時間對血小板計數結果有很大影響，通過對末梢血采集后不振蕩立即檢測和充分振蕩混勻靜置5 min后檢測結果進行分析，結果顯示未振蕩的計數值與充分振蕩混勻靜置5 min后的計數值差別甚大，前者比后者平均低30×109/L左右，認為充分搖勻之后上機檢測結果穩定性較好；而與抗凝劑絡合形成的聚集體隨著時間的延長及血液與抗凝劑的充分混勻，乙二胺四乙酸鹽使血小板由盤狀變為球狀，血小板偽足回縮到細胞質內，相互纏繞的血小板解散[7]，故在采血混勻2～30 min后進行血細胞分析，可得到更加靠近真值的血小板計數結果，可提高結果準確性。

實際操作中，門診患者(尤其是夜間急診患者)由于急需報告，檢驗人員通常會盡可能快地檢測，使標本待測時間縮短，導致血小板結果偏低。本實驗中，第一次檢測發現血小板計數結果低于100 g/L的有11例；其中再次檢測結果正常的標本有9例，占14.5%；2例再次檢測結果仍低于100 g/L，但較第一次檢測結果要高，1例再次檢測無變化，可認為是真性減少；其余52例第一次檢測血小板雖然＞100 g/L，但與再次檢測后血小板計數結果相比，結果普遍都偏低。而充分混勻2 min后檢測與0.5 h內檢測結果無太大差異，與手工計數法也無明顯差別，可見EDTA-K2抗凝末梢血在充分混勻2 min后檢測血小板數可基本消除血小板可逆性聚集的影響，因此末梢血采集后盡可能充分混勻兩分鐘后再檢測。值得一提的是，這種現象在冬天較為明顯，可能是血液與冰冷的抗凝劑接觸后溫度驟然降低，引起冷凝集所致，在影響血小板計數的因素中，冷凝集因素[8-9]也是其中之一。因此在遇到此類問題時最好重復檢測，必要時涂片鏡檢，避免血小板計數假性減少，給臨床造成極大的困擾。

[1]葉應嫵,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗操作規程[M].3版.南京:東南大學出版社,2006:10.

[2]李勝發,程大林.血小板可逆聚集在全血細胞分析中的影響[J].臨床檢驗雜志,2003,21(1):37.

[3]許文榮,王建中.臨床血液血與檢驗[M].4版.北京:人民衛生出版社,2007:339.

[4]申志紅,楊宇溪.血小板可逆聚集致血細胞分析儀誤報血小板減少[J].臨床誤診誤治,2008,21(10):73.

[5]鐘素萍,馬粵健.Sysmex KX-21型血細胞分析儀計數血小板的影響因素的探討[J].海南醫學,2007,18(8):132-133.

[6]汪兆亮,蔡敏琪,王湘云.末梢血混勻程度與靜置時間對血小板計數的影響[J].西南軍醫,2006,8(6):51.

[7]叢玉隆.當代血液分析技術與臨床[M].北京:人民衛生出版社,1997:33-34.

[8]Kurata Y,Havashi S,Iouzaki K,et al.Four cases of pseudothrombocytopenia due to platelet cold agglutinins[J].Rinsho Ketsueki,2006,47(8):781-786.

[9]Schimmer A,Mody M,Sager M,et al.Platelet cold agglutinins:a flow cytometric analysis[J].Transfus Sci,1998,19(3):217-224.