正交試驗(yàn)優(yōu)選杜仲中綠原酸的提取工藝

孫利偉，趙 輝，蔡楠楠

（1.河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000； 2.河南大學(xué)藥學(xué)院，河南 開封 475004）

杜仲為杜仲科植物杜仲 Eucommia ulmoides Oliv.的干燥樹皮[1]，是我國(guó)獨(dú)有的古老珍貴經(jīng)濟(jì)樹種，綠原酸為其主要有效成分之一[2]。筆者采用正交試驗(yàn)法，以杜仲中綠原酸的含量為考察指標(biāo)，確定最佳提取工藝，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LC－2010A型高效液相色譜儀，島津UV檢測(cè)器（日本島津）；101－2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司）；N－1001S型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。杜仲采自靈寶市中國(guó)林科院經(jīng)濟(jì)林研究開發(fā)中心，經(jīng)河南大學(xué)李欽教授鑒定為杜仲科植物杜仲 Eucommia ulmoides Oliv.；綠原酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為0753－9910）；乙腈（色譜純，merck公司）；甲醇（色譜純，天津四友精細(xì)化工試劑廠）；水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil－C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇－水－冰醋酸（17∶83∶1.5）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL。在此條件下色譜圖見圖1，綠原酸保留時(shí)間為31.17min。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 溶液配制

精密稱取綠原酸對(duì)照品4.70mg，置10mL容量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液，備用。取本品約1 g，剪成碎片，揉成絮狀，精密加入溶劑50mL，稱定質(zhì)量，按試驗(yàn)要求（超聲或回流）處理，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用50％甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取2.1.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1.41μg（3μL），2.35μg（5μL），4.70μg（10μL），7.05μg（15μL），9.40μg（20μL）。以峰面積為橫坐標(biāo)、進(jìn)樣量（μg）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。得回歸方程為 Y=6.71×10－3+3.07×10－6X，r=0.999 9（n=5）。結(jié)果表明，綠原酸的進(jìn)樣量在1.41～9.40μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液5μL，進(jìn)樣，連續(xù)5次，測(cè)量峰面積。結(jié)果的 RSD=1.4％（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12h時(shí)進(jìn)樣20μL，測(cè)定綠原酸峰面積積分值。結(jié)果的 RSD=1.38％（n=5），表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批已知含量的杜仲粉末6份，分別加入0.47 g/L的對(duì)照品溶液1mL，按供試品溶液制備方法制得溶液，測(cè)定含量并計(jì)算，結(jié)果見表1。

2.1.4 樣品含量測(cè)定

按照最佳工藝條件，20％甲醇超聲方法提取2次，每次1h，提取后，經(jīng)測(cè)定，杜仲中綠原酸含量為2.28％。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

綠原酸極性大，經(jīng)預(yù)試，選取4個(gè)因素2個(gè)水平，以L8（2）7正交表安排試驗(yàn)，因素水平表見表2，試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析見表4，

二元表見表5。

表1 綠原酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表2 因素水平表

表3 正交試驗(yàn)表及結(jié)果

表4 方差分析表

表5 A和B的二元表（％）

3 討論

綠原酸極性較大，水溶性好，既易溶于水，又易溶于乙醇、丙酮、甲醇等極性溶劑，微溶于乙酸乙酯，難溶于三氯甲烷、乙醚、苯等親脂性有機(jī)溶劑。有研究顯示，60％甲醇水溶液回流提取效率高[3]。亦有研究顯示，30％乙醇溶液超聲提取法簡(jiǎn)便，與回流比較二者無顯著性差異[4]。筆者對(duì)同一批杜仲分別用10％甲醇、25％甲醇、50％甲醇、75％甲醇、100％甲醇、10％乙醇、25％乙醇、50％乙醇、75％乙醇、100％乙醇分別進(jìn)行回流提取0.5h共2次，結(jié)果分別為2.19％，2.16％，2.11％，2.05％，2.11％，1.93％，1.94％，1.89％，1.90％，1.87％；以上述10種不同濃度的甲醇、乙醇溶液超聲處理杜仲樣品2次，每次0.5h，結(jié)果分別為1.87％，1.88％，1.78％，1.69％，1.69％，1.77％，1.80％，1.79％，1.73％，1.74％。兩種方法比較，發(fā)現(xiàn)甲醇平均提取率高于乙醇；對(duì)不同濃度的甲醇測(cè)定結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)不論回流提取還是超聲提取，甲醇濃度低時(shí)結(jié)果偏高，隨著甲醇濃度的不斷上升，提取效果變化不明顯，且從本次試驗(yàn)結(jié)果判斷，無規(guī)律可循。考慮方便于較大量提取時(shí)的濃縮工作，對(duì)甲醇高、低兩種濃度進(jìn)行考察，而不選擇經(jīng)濟(jì)但不利于較大批量濃縮的水和成本較高的純甲醇。

在提取時(shí)間上，對(duì)同一批杜仲分別回流提取0.5，1，1.5，2h，各提取 2次，含量測(cè)定結(jié)果分別為 2.10％，2.24％，2.25％，2.23％，可見隨著時(shí)間延長(zhǎng)，提取率無明顯變化。在提取次數(shù)上，通過試驗(yàn)結(jié)果比較，對(duì)同一批杜仲以50％甲醇為溶劑，回流提取1h，次數(shù)分別為1，2，3次，含量測(cè)定結(jié)果分別為1.81％，2.25％，2.25％，可見提取次數(shù)增多，提取效果差異不明顯，且提取2次效果明顯優(yōu)于提取1次。

由表2和表3數(shù)據(jù)分析顯示，根據(jù)極差 R的大小，判斷各因素及交互作用的主次關(guān)系為A＞B＞A×B＞D＞C，可見A×B也是影響試驗(yàn)結(jié)果的重要因素，為此列二元搭配均值表。方差分析結(jié)果顯示，提取方法（因素A）對(duì)綠原酸的提取效果影響最大，考慮交互作用，最佳工藝條件為A2B2C2D2，即20％甲醇超聲提取2次，每次1h，提取效率與直觀分析結(jié)果一致。

彭密軍等[5－6]用正交試驗(yàn)法對(duì)杜仲中的活性成分京尼平苷酸及桃葉珊瑚苷的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選研究，確定了最佳提取工藝。葉文峰等[7]用正交試驗(yàn)方法探討了以乙醇為溶劑提取杜仲葉中黃酮類化合物的最佳工藝條件。本試驗(yàn)以杜仲中綠原酸的含量為考察指標(biāo)，確定了最佳提取工藝，從而為杜仲的綜合開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：154.

[2]杜紅巖.杜仲活性成分與藥理研究的新進(jìn)展[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2003，21（2）：58.

[3]劉圣金，狄留慶，吳德康，等.高效液相色譜法測(cè)定杜仲中綠原酸的含量[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2006，13（1）：45.

[4]白 梅.陜西產(chǎn)杜仲中綠原酸含量測(cè)定研究[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（5）：71.

[5]彭密軍，周春山，雷啟福，等.杜仲中京尼平苷酸的提取工藝研究及應(yīng)用[J].中國(guó)中藥雜志，2004，29（3）：229－231.

[6]彭密軍，周春山，鐘世安，等.杜仲中桃葉珊瑚苷的提取工藝研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2003，23（3）：65－68.

[7]葉文峰，陳 新，劉秀娟，等.杜仲葉中黃酮類化合物的提取工藝[J].江西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，25（1）：69－71.