Y染色體AZFc區缺失與原發性男性不育相關性研究

(昆山市錦溪人民醫院男性科，江蘇 昆山215300）

姚衛國(興化市第五人民醫院男性科，江蘇 興化225766）

不孕不育一直是生殖健康領域亟待解決的重大科學問題。根據世界衛生組織統計，世界上有8%～15%的育齡夫婦患有不育癥，其中由男方原因引起的不育占一半左右。造成男性不育的原因很多，主要包括生精障礙、輸精管道梗阻、附屬性腺器官異常、性功能異常、全身性疾病引起的不育等。其中又以精子發生障礙最為常見。而在精子發生障礙的患者中有大約30%的患者是由于遺傳學的異常引起的 。自Tiepolo等發現 “無精子癥因子(azoospermia Factor）”以來，Y染色體微缺失被認為是原發性男性不育的重要原因，并成為男性不育研究的熱點[1]。

“無精子癥因子”分布于Y染色體長臂的三個不同區域，被稱為AZFa、AZFb和AZFc[2]。與其他染色體不同，Y染色體上約95%的區域不會與X染色體發生重組，所以被稱為非重組區(non-recombining region，NRY），也稱為男性特異區(MSY），其上某些序列經過了自我復制，相互之間高度同源，即存在回文序列(palindrome）結構，Y染色體的這種特殊的結構容易發生非等位同源重組，進而產生各種大片段的缺失，AZFc區域尤其容易發生缺失，因為該區域完全由回文序列結構構成，從而容易誘發該區內的各種缺失再發[3-4]。例如，典型AZFc缺失亞型b2／b4缺失發生在擴增子b2和擴增子b4之間。b2／b4缺失使整個AZFc區域(包含8個基因，其中3個編碼睪丸特異性蛋白）缺失，是我們所知的與精子生成障礙緊密相關的確定的病因[5]（圖1）。在AZFc區的結構被鑒定之后，AZFc區部分缺失以及導致這些缺失的潛在的分子機制的探究引起了更多的關注[6]。

圖1 AZFc區重復序列結構及STS位點布局

gr／gr部分缺失和b2／b3部分缺失是AZFc區部分缺失的兩種主要缺失形式。gr／gr部分缺失是由于順向重復序列(g1-r1-r2和g2-r3-r4）間發生同源重組，造成AZFc區中約1．6Mb長的片斷及其上基因拷貝被去除。b2／b3部分缺失是在gr／rg倒位或b2／b3倒位的基礎上進一步發展而來，造成AZFc區中約1．8Mb長的片斷及其上基因拷貝被去除。但是學術界對它們在精子生成過程中的影響作用存在爭論。

本課題以昆山市錦溪人民醫院與興化市第五人民醫院為樣本采集點，開展了以醫院人群為基礎的分子流行病學病例—對照研究，我們采用了多種特殊的序列示蹤位點(STS）標志物相結合的辦法[6-8]，檢測原發性不育和正常人群樣本缺失情況。從分子水平探討Y染色體AZFc區部分缺失同男性原發性不育之間的關系，為高危人群的篩檢和更好的開展輔助生育工作提供理論依據。

1 對象與方法

1．1 對象

本研究病例來自昆山市錦溪人民醫院、興化市第五人民醫院的男性不育門診病例；對照來自昆山市錦溪人民醫院自愿參加生殖內分泌激素水平和血清代謝物水平檢測的，有正常生育史的男性醫院內對照。病例和對照均來自中國東部的漢族人群，并且年齡匹配。

研究對象的選擇和排除標準：所有原發不育病例均無生育史，并且通過體格檢查，精液常規檢查，血清FSH，LH和T檢測和核型分析。通過這些檢測確診原發不育病例393例，年齡25～38歲，并且根據WHO男性不育診斷手冊[8]，將其分為3組，即：無精病人191例、少精病人 [精液密度：（0．1～20）×106／ml]121例、不育／精子生成正常患者(精液密度：＞20×106／ml）81例。所有對照均有近期生育史(1年內），并且進行了體格檢查。最終入選對照214例。研究對象均簽署知情同意書，且完成流行病學調查和提供血液標本。

1．2 方法

1．2．1 基因組DNA提取 采集靜脈血5ml，采用傳統的酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，用紫外分光光度法(A260／280比值）確定DNA純度，OD260測定DNA濃度。

1．2．2 Y染色體AZFc區缺失類型檢測 序列標簽位點(Sequence Tagged Site，STS）是一類在基因組上用以區分不同片段的特征序列，長度從幾十個堿基到幾百個堿基不等。當染色體上的某個區域有缺失發生時，這段區域連同其上的STS位點會被一同去除。所以，對候選缺失區域上各種STS位點的檢測，可以確定缺失發生所涉及的具體DNA片段。STS位點可以直接通過PCR擴增后電泳檢測，具有高效和快速的優點，適合大樣本人群的檢測。因此我們選用該方法檢測AZFc區部分缺失。AZFc區部分缺失檢測包括三個PCR體系：體系一：sY1206、sY1161、sY639；體系二：sY1291、sY254、sY160；體系三：sY1201，sY1191，sY1125。其中sY1191和sY1291具有最高的信息量，sY1191缺如代表b2／b3缺失，sY1291缺如代表gr／gr缺失，若sY1191和sY1291同時缺如代表AZFc全缺失。

1．3 統計學分析

計數資料的比較采用χ2檢驗，對于理論頻數小于5的采用Fisher’精確概率法。采用Wloof檢驗計算相對危險度及95%可信區間。對各種缺失類型與原發性男性不育相關性進行單因素統計分析。全部統計學檢驗均為雙側檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。統計分析軟件為Stata 9．0。

2 結 果

2．1 AZFc全缺失在不同生精狀態組間的分布

在本研究中共檢測AZFc全缺失28例，且全部來自病例組(其中21例來自無精組，7例來自少精組），而在正常對照組中沒有檢測到。

2．2 AZFc區部分缺失在不同生精狀態組間的分布

通過對研究對象AZFc區部分缺失(gr／gr和b2／b3）的檢測，分析gr／gr部分缺失和b2／b3部分缺失在不同精子生成狀態組間的頻率分布情況(見表1）。在214例正常對照中，共檢測到18例gr／gr部分缺失、9例b2／b3部分缺失，而在393例原發性男性不育病例中，共檢測到41例gr／gr部分缺失、36例b2／b3部分缺失樣本。b2／b3部分缺失在原發性男性不育組和正常對照組間的頻率分布具有統計學差異(OR=2．49，95%CI：1．18～5．28，P=0．014），而gr／gr部分缺失在這兩個組之間的分布沒有差異。上述結果提示b2／b3部分缺失會增加原發性男性不育的風險性。

造成男性不育的因素很多，那么b2／b3部分缺失是通過什么途徑引起男性不育的呢？為了探討這個問題，隨后我們將原發性男性不育細分為無精組、少精組、不育／精子生成異常組(包括無精和少精）以及不育／精子生成正常組。在191例無精病人中，總計檢測到gr／gr部分缺失21例、b2／b3部分缺失17例；在121例少精病人中，檢測到gr／gr部分缺失13例，b2／b3部分缺失11例；在81例不育／精子生成正常組中，檢測到gr／gr部分缺失7例，b2／b3部分缺失8例。通過對AZFc區部分缺失在不同生精表型組間分布頻率的分析，我們發現，與對照組相比，b2／b3部分缺失在無精組(OR=2．53，95%CI：1．10～5．83，P=0．025）、少精組(OR=2．43，95%CI：0．98～6．06，P=0．05）及不育／精子生成異常組(OR=2．49，95%CI：1．15～5．40，P=0．017）的頻率差異具有統計學意義(見表1）。

上述結果表明，b2／b3部分缺失會增加原發性男性不育發生的風險性，而且這種風險性是通過精子生成障礙引起的。

表1 gr／gr和b2／b3部分缺失在不同生精表型組間的分布

3 討 論

近年來，Y染色體微缺失及AZFc區部分缺失成為男性不育研究的熱點。在世界范圍內，不同研究人群因為種族等方面的原因Y染色體缺失的發生頻率各異，從5%到20%各不相等[9-13]。與典型AZF區缺失相比，AZFc區部分缺失表型存在多樣性。通過STS組合分析方法[9]，我們對該人群中兩種主要缺失類型進行了檢測分析：gr／gr部分缺失和b2／b3部分缺失。我們研究發現，中國漢族男性人群中gr／gr部分缺失和b2／b3部分缺失的頻率要顯著高于其他不同人群。

在中國漢族人群這393名男性不育患者中，gr／gr部分缺失的頻率(10．43%）要比美國研究人群所檢測出的結果(2．2%）高出很多，甚至要高于對歐美生精功能受損的患病人群所檢測出的結果（3．7%～5．1%）[14-17]。這也許是因為研究對象不同的遺傳背景造成的，而最近一項有關東亞人群的研究（病例組和對照組gr／gr部分缺失的患病率分別是10．3%和10．1%）也證實了這一點[18]。本研究與歐洲的一些相關的研究結果不同[19]，病例組和對照組在gr／gr缺失頻率上沒有明顯的差異(分別為10．43%和8．41%），提示gr／gr部分缺失與中國漢族人群中原發性男性不育無顯著關聯[20]。考慮到我們所研究的人群是中國漢族男性人群，特定的遺傳背景也許再一次發揮了效力。

首次被Sjoerd Repping’s課題組所闡釋的b2／b3部分缺失曾一度被人們所忽視。他們對1563位男性進行了檢測，發現有25例缺少sY1191位點，但卻具有該位點兩側的STSs。在經過原位雜交熒光測定的確證之后，他們發現這種特殊缺失類型發生在b2／b3擴增子之間[16]。由于其發生頻率較低，b2／b3部分缺失對男性不育影響程度仍然是未知的[21]。在本研究中，我們發現，b2／b3部分缺失的發生率在原發性男性不育組(9．16%）與正常對照組(4．21%）之間，具有顯著差異(P=0．014）。那么b2／b3部分缺失是通過什么途徑影響男性不育的呢？隨后我們將病例樣本細分為無精組、少精組以及不育／精子生成正常組。結果顯示b2／b3部分缺失在無精組(P=0．025）、少精組(P=0．050）以及不育／精子生成異常組(P=0．017）的發生率顯著高于正常對照組，而在不育／精子生成正常組中的發生率與對照組相比沒有顯著差異(P=0．062）。綜上可以得出：b2／b3部分缺失與精子生成障礙之間有著顯著關聯，即b2／b3部分缺失會增加精子生成障礙的風險性。

AZFc區是正常生精功能所必需的，b2／b3缺失使AZFc上1．8Mb的長度丟失，其中包括12個睪丸特異表達的基因或轉錄子。與使AZFc區上1．6Mb長度丟失的gr／gr部分缺失相比，b2／b3部分缺失多出三個基因拷貝缺失，包含1個BPY2拷貝、1個TTTY4拷貝和1個TTTY17拷貝。考慮到這兩種部分缺失與男性不育關聯程度的不同，一種可能的原因就是存在與精子發生相關的特定的基因拷貝。其次，盡管是相同的基因，不同拷貝的缺失可能會有不同的結局，而這最有力的證據來自DAZ基因家族。已知DAZ基因家族有4個高度同源的拷貝，它們在功能上可能并不完全相同[19]。Ferlin的研究發現DAZ1／2缺失和DAZ3／4缺失對生精功能損傷程度不同，為上述推斷提供了有力的佐證。

總的來說，此種關聯性研究為后續的功能學研究起到了一定的鋪墊作用。我們需要更大規模人群樣本來驗證這種關聯的存在，全面闡述AZFc區不同基因及其不同拷貝在精子發生中的作用，為男性不育的診斷和治療提供新的思路。考慮到AZFc區部分缺失可能遺傳給男性后代[21-23]，因此，在行IVF（in-vitro fertilization）或ICSI(intracytoplasmic sperm injection）治療之前有必要對男性 AZF微缺失以及部分缺失的情況進行檢查，并告之不育夫婦可能發生的遺傳學后果，為其提供遺傳學咨詢，以降低不良遺傳后果的發生率。

[1]Tiepolo L，Zuffardi O．Localization of factors controlling spermatogenesis in the nonfluorescent portion of the human Y chromosome long arm [J]．Hum Genet，1976，34：119-124．

[2]Vogt P H，Edelmann A，Kirsch S，et al．Human Y chromosome azoospermia factors（AZF）mapped to different subregions in Yq11 [J]．Hum Mol Genet，1996，5：933-943．

[3]Skaletsky H，Kuroda-Kawaguchi T，Minx P J，et al．The male-specific region of the human chromosome is a mosaic of discrete sequence classes[J]．Nature，2003，423：825-837．

[4]Simoni M，Bakker E，Krausz C．EAA／EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions [J]．Int J Androl，2004，27：240-249．

[5]Kuroda-Kawaguchi T，Skaletsky H，Brown L G，et al．The AZFc region of the Y chromosome features massive palindromes and uniform recurrent deletions in infertile men [J]．Nat Genet，2001，29：279-286．

[6]de Llanos M，Ballesca J L，Gazquez C，et al．High frequency of gr／gr chromosome Y deletions in consecutive oligospermic ICSI candidates [J]．Hum Reprod，2005，20：216-220．

[7]Giachini C，Guarducci E，Longepied G，et al．The gr／gr deletion(s）：a new genetic test in male infertility [J]？J Med Genet，2005，42：497-502．

[8]Fernandes S，Paracchini S，Meyer L H，et al．A large AZFc deletion removes DAZ3／DAZ4and nearby genes from men in Y haplogroup [J]．N Am J Hum Genet，2004，74：180-187．

[9]Vogt P H．Human chromosome deletions in Yq11，AZF candidate genes and male infertility：history and update [J]．Mol Hum Reprod，1998，4：739-744．

[10]Krausz C，McElreavey K．Y chromosome and male infertility [J]．Front Biosci，1999，4：1-8．

[11]Krausz C，Forti G，McElreavey K．The Y chromosome and male fertility and infertility [J]．Int J Androl，2003，26：70-75．

[12]Fernandes S，Huellen K，Goncalves J，et al．High frequency of DAZ1／DAZ2gene deletions in patients with severe oligozoospermia [J]．Mol Hum Reprod，2002，8：286-298．

[13]Repping S，Skaletsky H，Brown L，et al．Polymorphism for a 1．6-Mb deletion of the human Y chromosome persists through balance between recurrent mutation and haploid selection [J]．Nat Genet，2003，35：247-251．

[14]Repping S，van Daalen S K，Korver C M，et al．A family of human Y chromosomes has dispersed throughout northern Eurasia despite a 1．8-Mb deletion in the azoospermia factor region [J]．Genomics，2004，83：1046-1052．

[15]Ferlin A，Tessari A，Ganz F，et al．Association of partial AZFc region deletions with spermatogenic impairment and male infertility[J]．J Med Genet，2005，42：209-213．

[16]Machev N，Saut N，Longepied G，et al．Sequence family variant loss from the AZFc interval of the human Y chromosome，but not gene copy loss，is strongly associated with male infertility [J]．J Med Genet，2004，41：814-825．

[17]Hucklenbroich K，Gromoll J，Heinrich M，et al．Partial deletions in the AZFc region of the Y chromosome occur in men with impaired as well as normal spermatogenesis [J]．Hum Reprod，2005，20：191-197．

[18]Zhang F，Li Z，Wen B，Jiang J，et al．A frequent partial AZFc deletion does not Render an increased risk of spermatogenic impairment in East Asians[J]．Ann Hum Genet，2005，70：304-313．

[19]Lynch M，Cram D S，Reilly A，et al．The Y chromosome gr／gr subdeletion is associated with male infertility [J]．Mol Hum Reprod，2005，11：507-512．

[20]Fernando L，Gromoll J，Weerasooriya T R，et al．Y-chromosomal microdeletions and partial deletions of the azoospermia factor c（AZFc）region in normozoospermic，severe oligozoospermic and azoospermic men in Sri Lanka [J]．Asian J Androl，2006，8：39-44．

[21]Kent-First M G，Kol S，Muallem A，et al．The incidence and possible relevance of Y-linked microdeletions in babies born after intracytoplasmic sperm injection and their infertile fathers [J]．Mol Hum Reprod，1996，2：943-950．

[22]Jiang M C，Lien Y R，Chen S U，et al．Transmission of de novo mutations of the deleted in azoospermia genes from a severely oligozoospermic male to a son via intracytoplasmic sperm injection [J]．Fertil Sterility，1999，71：1029-1032．

[23]Oates R D，Silber S，Brown L G，et al．Clinical characterization of 42oligospermic or azoospermic men with microdeletion of the AZFc region of the Y chromosome，and of 18children conceived via ICSI [J]．Hum Reprod，2002，17：2813-2824．