葉蛋白提取分離及應用研究進展

柳青海，張唐偉，李天才

(1.中國科學院西北高原生物研究所，青海西寧810008; 2.中國科學院研究生院，北京100049)

葉蛋白提取分離及應用研究進展

柳青海1，2，張唐偉1，2，李天才1

(1.中國科學院西北高原生物研究所，青海西寧810008; 2.中國科學院研究生院，北京100049)

葉蛋白因具有資源豐富、營養價值高、不含動物性膽固醇等特點而備受關注，是一種具有良好開發價值的新型蛋白資源。細胞破碎的方法主要有研磨、組織搗碎等方法;提取的方法主要有酸(堿)加熱提法、發酵法、有機溶劑沉淀等方法;分離純化的方法主要有電泳、色譜等方法。葉蛋白在醫藥、食品、飼料等方面都有廣泛的應用。

葉蛋白，提取分離，細胞破碎，應用

1.1.1 研磨 劉建華等［6］采用干打漿的方法，將魯梅克斯嫩葉莖剪切成長0.5～1cm的小段，分數次用研缽研磨成糊狀，醫用紗布兩層疊放在一起，每次取少許研磨后的糊狀物放在紗布上，充分擠壓，擠出綠色汁液，從而分離出葉蛋白。該方法簡單，經常與其他方法結合使用。

1.1.2 組織搗碎法 這是一種較劇烈的破碎細胞的方法，通常可先用家用食品加工機將組織打碎，然后再用10000～20000r/min的內刀式組織搗碎機(即高速分散器)將組織的細胞打碎。宋葆華等［7］在ZK高速自控組織搗碎機中，加蒸餾水300mL，搗碎3min，比較107種植物中葉蛋白含量。

1.1.3 溶脹法 細胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，將細胞膜脹破釋放出細胞內含物。闞歡等［8］用100∶1的液料比，浸泡60min，從辣木葉中分離葉蛋白。李雪楓等［9］用此方法破碎柱花草葉細胞，從中提取葉蛋白。

1.2 提取方法

1.2.1 酸(堿)加熱提法 酸(堿)加熱提法是酸(堿)法和加熱法相結合的一種復合型葉蛋白提取方法。葉蛋白經等電點沉淀和熱變性雙重因素共同作用，增加了蛋白質凝聚機會，使葉蛋白凝聚快、凝聚物結構緊密易分離，保證了葉蛋白的高提取率。吳峰華等［10］利用堿提酸沉法，考察了提取溫度、提取時間、pH和料液比對豆腐柴葉蛋白提取率的影響，表明溫度為50℃，時間為80min，pH為11，料液比為1∶30，豆腐柴葉蛋白提取率可達到82.04%。趙希艷等［11］采用紫花苜蓿葉為原料，酸(堿)加熱法提取紫花苜蓿葉蛋白，確定獲得葉蛋白高產率的最優條件為:pH4.5、溫度80℃，加熱時間5min。酸(堿)加熱法的主要優點是流程短操作方便、沉淀快、易于過濾收集等。但該工藝的缺點是酸(堿)等條件造成蛋白水解、影響蛋白活性。

1.2.2 發酵法 利用乳酸菌產生的乳酸等改變漿液的pH到蛋白質的等電點，使蛋白沉淀，再通過離心得到葉蛋白。曾凡枝等［12］用該法從苜蓿中提取葉蛋白，實驗結果表明，各因素對苜蓿葉蛋白提取率的影響順序為:發酵溫度＞乳酸菌數＞發酵時間，實驗發酵時間10h左右，發酵溫度34℃。劉鵬等［13］將乳酸的發酵酸與植物葉榨汁液按體積比3∶1混合，攪拌靜置后，離心得到葉蛋白沉淀，實驗發現發酵酸新鮮程度、乳酸菌數量多少、生物活性高低等因素，對葉蛋白聚凝和提取效率都有影響。發酵法提取葉蛋白的優點是使植物葉中對動物機體有害的物質失去活性，提高了蛋白質品質，能耗少，提取效率高，是生產葉蛋白的一種節能環保的優良工藝。

1.2.3 有機溶劑沉淀 Walter J.Bray等［14］用聚丙烯酰胺A150可高效的提取紫花苜蓿和黑麥草汁液中的白色葉蛋白。韋吉等［15］研究不同提取條件對熱研號柱花草葉蛋白凝集的影響，表明其溶劑的選擇及質量分數、pH、加熱時間和溫度對蛋白提取均有影響。有機溶劑提取法是目前較為常見的提取葉蛋白的方法，其優點是沉淀快、絮凝物結構緊密，易過濾收集。且經有機溶劑脫色生產的脫色葉蛋白具有含糖量低、蛋白成分較為單一等高營養價值，可用于抗癌、營養保健食品的開發。

1.2.4 直接加熱法 劉建華等［6］用魯梅克斯做原料比較了直接加熱法、凝絮法和加酸法3種提取方法，結果直接加熱法提取葉蛋白的產率相對較高。施正香等［7］研究表明，直接加熱法能較好地促使葉蛋白絮凝，加熱溫度對葉蛋白提取效果有明顯影響，50℃和90℃是提取率最高的兩個點;植株葉的幼嫩程度對葉蛋白提取率有影響，在處理溫度相同時，同種植物越幼嫩，葉蛋白絮凝沉淀越容易，葉蛋白提取率越高。李雪楓等［9］用此方法提取柱花草葉蛋白，提取溫度為80℃。鄒文輝等［16］對草坪草屑葉蛋白提取方法進行比較，直接加熱法和酸化加熱法之間無顯著差異，但直接加熱法具有較好的絮凝沉淀效果，且容易過濾，因此，直接加熱法是提取草坪草屑葉蛋白的一種較好的方法。

1.2.5 其他方法 葉蛋白的提取方法還有超濾法、等電點沉淀法、結晶和重結晶法、酸堿法等，也有將不同的提取方法綜合在一起使用的。Werner Koschuh等［17］用超濾法從黑麥汁液中提取葉蛋白的得率為59%，而用加熱法的得率為45%。闞歡等［8］用浸提及等電點法從辣木中提取分離葉蛋白，等電點分離 pH為4.0～5.0時，產品的蛋白質含量達68.86%，蛋白質提取率達70%。Aruna RPGA等［18］用酸提法從廢茶葉渣中提取葉蛋白，pH4.4時，葉蛋白提取率達69%。劉曉穎［19］以黑麥草為原料采用酸加熱和有機溶劑相結合的方法對其葉蛋白進行抽提，測得葉蛋白中粗蛋白質含量高達32%～58%。可以看出，將有機溶劑提取和酸化加熱法結合在一起可以獲得較高的蛋白提取率。如果能在方法上得到進一步的改變，使得葉蛋白提取的成本降低，將為我們尋求新的蛋白資源提供更多的選擇。

2 葉蛋白分離純化

葉蛋白中含有多種蛋白，通過一系列物理、化學、生物等技術將其分開，得到相對較純的蛋白，有利于葉蛋白的進一步研究，尋找新的活性蛋白，對開發葉蛋白有著重要意義。目前純化蛋白的方法主要有電泳法、色譜等方法。

2.1 電泳法

帶電荷的供試品(蛋白質粗提液)在惰性支持介質(如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)中，于電場的作用下，向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動，使組分分離成狹窄的區帶，達到對不同物質的分離。謝正軍等［20］用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將苜蓿葉提取的粗蛋白分成不同的組分，確定其分子量大小。Gomez-Vidal S等［21］用二維電泳的方法(2-DE)從棗椰樹葉中分離出五種純蛋白。Silas Pessini Rodrigues等［22］用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)從番木瓜葉中提取出15種蛋白。

2.2 色譜法

2.2.1 凝膠過濾 根據分子量大小不同在色譜柱中的分配速度不同，分子量大的流出較分子量小的快，進而將其分離。馬麗等［23］用葡聚糖凝膠G-200凝膠色譜及Sephadex A.50，從元寶楓葉片中提取并純化了葉蛋白，其中蛋白酶的比活性為1408.04U·mg-1，純化倍數50.77。Mylarappa Bantaganahalli Ningappa等［24］用Sephadex G-75和Sephadex G-25從麻絞葉中分離純化出一種蛋白，該蛋白分子量為35kDa。Pereira CA等［25］用Q-瓊脂糖凝膠(Q-Sepharose)從木薯葉中分離蛋白。

2.2.2 離子交換層析 根據蛋白帶電性質的不同，與交換劑發生交換，改變洗脫液pH或離子強度，將其洗脫而達到分離的目的。Dhira j.Vyas等［26］用DEAE-cellulose從茶葉蛋白提取物中分離出具有抗氧化作用的蛋白。Sharma P等［27］用DEAE從水稻葉中分離出具有活性的兩種蛋白，其分子量28.5kDa和34kDa。

3 葉蛋白應用研究

3.1 藥用價值

國內外在葉蛋白藥用方面研究的較多，如葉蛋白在抗氧化、預防心血管病、抗腫瘤、治療關節炎、肺氣腫、老年性白內障等方面的作用有研究報道。

3.1.1 抗氧化 謝正軍等［20］對苜蓿葉蛋白及其水解產物抗氧化實驗研究表明，苜蓿葉蛋白水解產物具有明顯的抗氧化功能。傅曉［28］用苜蓿葉蛋白對大鼠飼養結果證實，葉蛋白可提高谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧物歧化酶(SOD)的活力，降低氧化產物丙二醛(MDA)的濃度，增強機體抗氧化酶系統的功能。Mylarappa Bantaganahalli Ningappa等［24］從麻絞葉中分離出蛋白，該蛋白具有抗氧化和清除自由基的作用。Dhira j.Vyas等［26］從茶葉蛋白提取物中分離出具有抗氧化作用的蛋白。Sharma P等［27］從水稻葉中分離出兩種具有活性的蛋白，有顯著的抗氧化作用。

3.1.2 預防心血管病 活潑等［29］從茶葉中提取蛋白，通過實驗證明其具有明顯的降血脂效果，對動脈粥樣硬化及冠心病可能有一定的預防作用。鄧勇等［30］通過苜蓿葉蛋白強化膳食營養學實驗證明:進食苜蓿葉蛋白能明顯提高大學生血紅蛋白的含量，改善貧血狀況。EWA D.Marczak等［31］研究結果表明，從菠菜中提取葉蛋白對高血壓小鼠的血管緊張素轉移酶活性有顯著的抑制作用，能夠起到降血壓作用。

3.1.3 抗菌作用 Kyoko Hayashi等［32］研究表明，從絲蘭屬植物葉中提取的葉蛋白，能阻止單純皰疹病毒感染細胞后蛋白合成系統，從而阻止其在宿主細胞內繁殖，該發現對開發植物的葉蛋白具有重要意義。

3.2 保健食品

粗葉蛋白富含維生素和葉黃素，不含動物蛋白所含的膽固醇，可作為兒童和成人的食用蛋白源和食品添加劑，被聯合國糧食及農業組織認為是一種高質量食品。鄭建仙［33］將苜蓿葉蛋白應用到面條中，在添加量不超過4%時，不改變面團流變學特性和口感;即使苜蓿葉蛋白的加入量達5%，也不會影響面條的加工性能。Devadas等［34］將苜蓿葉蛋白作為食物實驗研究表明:其容易消化，還可促進生長，同動物蛋白相比，其成本低廉，在經濟欠發達地區是一種理想的食品。Prevot-Dalvise等［35］用酶膜反應器水解苜蓿葉蛋白分離制備的葉蛋白肽，其溶解性、乳化性能、發泡性能均有較大改善，可用于食品工業。葉蛋白對人體具有多種功能，它進入人們的膳食結構后，將會降低高膽固醇對健康的危害。

3.3 飼料方面

葉蛋白含有動物必需氨基酸，粗蛋白質含量較高，是豬、雞、牛、羊良好的蛋白質補充飼料。對家畜適口性好、營養價值高、明顯增加體重、改善禽畜魚蛋等產品品質、具有良好的飼養效果，可作為家畜飼料添加劑，也可直接制成葉蛋白飼料直接進行飼喂。Delic［36］用含50%粗蛋白的苜蓿葉蛋白濃縮物代替蛋雞日糧中3%的大豆餅，產蛋率增加3%，平均蛋重由55.8g提高到57.7g，飼養成本降低，蛋黃中β-胡蘿卜素含量增加14%，且蛋黃中葉黃素積累增多，色澤提高。李玉清等［37］實驗表明，在蛋雞生產中用5%、10%菠菜葉蛋白替代相應比例的豆粕飼喂“種禽褐”商品代蛋雞，生產性能不受影響;同時還可提高蛋黃顏色和經濟效益。潘行正等［38］在飼料中添加西蘭花葉蛋白對仔豬生產性能的實驗表明，適量添加葉蛋白對斷奶仔豬的采食量影響不顯著，但添加量提高到6%時可顯著影響仔豬的采食量，在飼料轉化率方面，3%葉蛋白組效率最高，表明西蘭花葉可用于代替等量日食的飼料。

3.4 其他方面用途

葉蛋白除了用于醫藥、保健食品、飼料外，還可用于化妝品、洗滌用品等日用化工用品和植物生長營養調節劑等方面，也可將葉蛋白作為原料進一步分離制得葉綠素、胡蘿卜素、純蛋白質、維生素E等許多功能性物質，而且葉蛋白的應用領域正在不斷拓寬。葉蛋白純化后活性蛋白研究，以及多肽等的研究越來越多。

4 前景與展望

葉蛋白資源豐富，加工過程簡單，成本低，有利于規模化生產，而國內在葉蛋白的深加工方面相對滯后，目前國內對葉蛋白的研究主要集中于提取，而對于其進一步深加工研究較少，需要在葉蛋白應用方面進行更多的研究，使其生產加工能形成產業化、規模化，深加工產品能廣泛的應用于醫藥、食品等方面，獲得更大的經濟價值。國內對蛋白需求大，尤其是畜牧養殖業，而國內蛋白資源相對缺乏，所以葉蛋白具有良好的開發前景。

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Review on extraction，purification and application of leaf protein

LIU Qing-hai1，2，ZHANG Tang-wei1，2，LI Tian-cai1
(1.Northwest Institute of Plateau Biology Chinese Academy of Science，Xining 810008，China; 2.Graduate University，Chinese Academy of Science，Beijing 100049，China)

Leaf protein has been paid much attention for its plenty of sources，high nutrition and nocholesterol，it was a new type of protein resources.Methods to crash cell included grinding，crushing and other methods.Crude leaf protein extraction methods were acid heating，the direct fermentation，organic solvent precipitation and other methods.Protein separation and purification methods included electrophoresis，chromatography and so on.Leaf protein widely used in medicine，food，feed and so on.

leaf protein;extraction and purification;cell breakage;application

TS201.2+1

A

1002-0306(2011)09-0468-04

葉蛋白(Leaf protein concentration，LPC)是從新鮮植物莖葉，經壓榨取汁、液中蛋白質分離和濃縮干燥而制備的高質量濃縮物［1］。研究表明，葉蛋白制品含蛋白質50%～70%［2］。據文獻報道，苜蓿葉蛋白食用效果好，可消化率為62%～72%，能量代謝率為69%～90%，每千克葉蛋白中代謝能為 2800～3200kcal［3］。葉蛋白中含有18種氨基酸，其中含8種人體必需氨基酸，錢愛萍等［4］研究表明，烏飯樹葉蛋白質中總氨基酸含量為71.82%，必需氨基酸(EAA)占總氨基酸量的40.30%，第一限制性氨基酸為賴氨酸，氨基酸比值系數為77.05，必需氨基酸與非必需氨基酸含量的比值為0.674，分別高于WHO/FAO標準規定的40%和0.6。遲桂榮［5］對菹草和浮萍研究表明，這兩種植物中葉蛋白中粗蛋白含量為51.6%和42.3%。國內外對葉蛋白應用研究，主要集中在藥用(抗氧化、心血管病、抗菌等)、食品、飼料等方面。我國植物資源豐富，而在葉蛋白開發方面相對滯后，積極尋求開發新的蛋白資源具有十分重要的意義。

1 葉蛋白的提取

1.1 樣品的預處理

2010-09-09

柳青海(1985-)，男，碩士研究生，研究方向:藥用植物化學。