土壤微生物群落表征中磷脂脂肪酸（PLFA）方法研究進展

張瑞娟 ，李 華 ，林勤保 ，張 強 ，郜春花

（1.山西大學環境與資源學院，山西太原030006；2.山西大學應用化學研究所，山西太原030006；3.山西省農業科學院農業環境與資源研究所，山西太原030006）

土壤微生物（edaphon）是整個微生物界的重要成員。土壤具備微生物生存的基本條件，即營養物質（有機質、無機鹽、水分等）、自然環境（溫度恒定，中性環境）、生存空間（有氧或無氧），這些使得土壤成為微生物活動最適宜的場所，所以土壤素有微生物的“天然培養基”之稱。土壤中的微生物較水體和大氣中的數量要大，種類要多，因而土壤被稱為“微生物的大本營”[1]。

土壤微生物是土壤的重要組成部分，它對土壤肥力的形成和轉化起著積極作用[2-5]。土壤微生物群落是土壤生物區系中最重要的功能成分，土壤微生物本身不僅是土壤養分重要的來源，支撐著土壤肥力，還對其所生存的微環境十分敏感，能對土壤生態機制變化和環境脅迫做出反應，導致群落結構發生變化。所以，土壤微生物群落被認為是土壤生態系統變化的預警及敏感指標，指示土壤質量變化。

土壤微生物生態學研究的蓬勃發展很大程度上歸功于其研究方法的改進[6]。隨著分子生物學的發展，用于評價土壤微生物群落結構的新方法主要有Biolog法、磷脂脂肪酸（Phospholipid Fatty Acid，PLFA）法、DGGE（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）法等。鄭華等[7]對 Biolog法在土壤微生物群落功能多樣性研究中的應用進行了綜述。Xue等[8]用 Biolog，DGGE，PLFA 方法對不同利用方式（荒地、森林、茶園）的土壤微生物群落結構做了對比研究。Zaady等[9]結合PLFA，DGGE，物理及生物生理的方法對3種干旱水平（半干旱、干旱、過度干旱）的生物土壤結皮結構的微生物量及多樣性進行調查研究，結果表明，半干旱地區革蘭氏陽性（G+）和革蘭氏陰性（G-）的生物標記物明顯高于過度干旱地區，不同干旱水平下生物土壤結皮的不同可以作為評價全球氣候變化的依據。王曙光等[10]對Biolog法、PLFA法、DGGE法進行了闡述和比較，認為這3種方法均能針對土壤微生物特性、微生物群落結構和功能變化及差異進行獨立分析。

本文重點對PLFA法研究進展作一介紹。

1 土壤中磷脂脂肪酸（PLFA）簡介

磷脂幾乎是所有微生物細胞膜的重要組成成分，含量在自然生理條件下相對穩定，約占細胞干質量的5%，只存在于活體細胞膜中，一旦生物細胞死亡，磷脂類化合物會迅速降解[11]。由于不同種類微生物體內含有的磷脂脂肪酸（PLFA）的組成及含量差異顯著，一些脂肪酸可能只存在于某類微生物的細胞膜中，如：脂肪酸15∶0，i15∶0，a15∶0，17∶0，18∶1ω7 等用來表征細菌[11-12]；cy17∶0，cy19∶0 指示厭氧菌[11，13]；16∶0，18∶2ω6 等用來指示真菌；15∶0，a15∶0，i15∶0，10Me18∶0 等用來指示放線菌[11]；10Me16∶0，i15∶0，a15∶0，i16∶0，i17∶0，a17∶0 等表征革蘭氏陽性菌 （G+）；16∶1ω5c，16∶1ω7t，16∶1ω9c，18∶1ω5c，18∶1ω7c，cy17∶0，cy19∶0等可指示革蘭氏陰性菌（G-）[12]。所以，PLFA可以作為微生物生物量和群落結構變化的特征微生物標記物[13]，且適合于微生物群落的動態監測[14]。

2 PLFA方法介紹

2.1 土壤的預處理

Stenberg等[15]比較了土樣在（2±2）℃和（-20±2）℃下保存 1，3，6，13 個月對土壤微生物量的影響，研究結果顯示，土樣在-20℃下保存13個月的測定結果與鮮土的分析結果幾乎相同。該結果為我們在野外進行大批量采樣而無法及時完成分析測試工作，需經過冷凍保存過程提供了理論依據。

吳愉萍等[16-17]研究了不同土壤質量、土壤含水量、保存條件（鮮土和-70℃下冷凍干燥1 a的土壤）及提取方法（單個提取和連續提?。LFA方法的影響，結果表明，隨著土壤質量的增加，檢測到的PLFA越多，這就要求對于同一組試驗要保持土壤質量的恒定；調節土壤含水量沒有對PLFA的譜圖產生顯著影響；自制柱與商品柱（SPE柱）得到的結果幾乎相同；經冷凍干燥保存的土壤PLFA總量顯著下降，PLFA譜圖也發生了變化，因此，最好盡早對采集到的土樣進行PLFA分析。

劉岳燕[18]研究了淹育水稻土壤預處理與保存方法（淹育、淹育晾干、淹育冷凍、淹育晾干冷凍、淹育晾干冷藏）對土壤微生物多樣性的影響，結果證實，淹育水稻土的預處理和不同保存方法影響微生物群落結構，通過進一步分析發現，淹育冷凍處理的土壤微生物多樣性與淹育對照處理的結果更接近，表明淹育冷凍處理對淹育土壤微生物結構多樣性的影響較小。

?ernohlávková 等[19]研究了不同的保存溫度（4℃冷藏、-20℃冷凍、自然風干）和保存時間（2，4，8，16，32 周） 對土壤微生物生物量碳的影響，結果表明，保存時間超過4周，微生物生物量碳會發生顯著變化；-20℃冷凍保存8～16周，微生物生物量碳含量顯著降低；自然風干保存8周之后微生物量碳也顯著降低；4℃冷藏保存產生的影響最小，但并未對土壤微生物群落結構的變化作出評價。

劉艷青等[20]研究了新鮮和凍干土樣對河濱緩沖帶土壤微生物群落結構的影響，結果表明，用凍干土測定的微生物群落結構分布與用新鮮土測定的結果密切相關（r＝0.972，P＜0.000 1），但凍干土測定的PLFA總量的變異系數小于新鮮土樣，且用凍干土測得的PLFA總量、種類和樣品分析過程中加入的內標回收率均大于新鮮土樣，最終得出利用PLFA法分析土壤微生物群落結構時采用凍干土樣更加適合。

有很多學者對土樣的保存條件做了研究，但其結果不統一，甚至相反。Stenberg等[15]對造成這種結果的原因進行了探討，得出3個主要原因：一是微生物對特定的環境有適應能力，而自然條件不恒定；二是采樣時微生物的生長狀態不一，生長旺盛的細胞對冷凍或冷藏更為敏感；三是外界條件與微生物自身生長環境的差異幅度大小可能對微生物量產生影響。

2.2 PLFA的提取方法

常用的PLFA提取方法有2種[21]，一種是PLFA（Phospholipid Fatty Acid）法，另一種叫 EL提取法（Ester-Linked Extraction Method），也叫TSFAME（TotalSoilFattyAcidMethylEsters）法。2 種方法的主要區別[22]：前者分析的PLFA僅來自活體細胞膜，可了解土壤微生物群落的即時狀態；后者分析的PLFA部分來自土壤穩定有機質（土壤腐殖質、根系），反映土壤微生物代謝史。MIDI法是21世紀初新興起的一種直接提取脂肪酸的方法，最先應用于細菌純培養的分離鑒定，后推廣到土壤領域。

2.2.1 Phospholipid Fatty Acid（PLFA）法 此方法由Bligh等[23]于1959年創建，采用提取劑氯仿∶甲醇∶水，提取凍魚中的脂質物質，方法簡便、快速，但此方法當時僅限于食品，特別是魚類的磷脂提取。隨著現代研究領域的拓寬，該方法也被用于諸如土壤等其他方面，但前提是必須保證氯仿∶甲醇∶水的體積比為1∶2∶0.8。20世紀70年代末，White等[24]將提取劑改為氯仿∶甲醇∶磷酸鹽緩沖液（體積比為1∶2∶0.8），對江河、海洋沉積物中的微生物區系進行分析研究，并指出氯仿∶甲醇∶水的體積可以改變，只要滿足在單一相萃取中體積比為1∶2∶0.8，在第2階段分離時維持在1∶1∶0.9即可。20世紀90年代初，Frosteg?rd 等[25]認為，用酸性檸檬酸代替中性磷酸鹽緩沖液提取酸性高的有機質土壤，可提高磷脂回收率且避免無機磷污染。

PLFA法通用的步驟概括為 3步[26-28]：（1）提取（提取劑為氯仿∶甲醇∶檸檬酸緩沖液＝1∶2∶0.8，取上清液，提取2次，合并上清液，加檸檬酸緩沖液和氯仿，使氯仿∶甲醇∶檸檬酸緩沖液＝1∶1∶0.9，下層液（氯仿相）中包含磷脂）；（2）分離（固相萃取柱，洗脫劑為氯仿、丙酮、甲醇，收集甲醇相）；（3）甲酯化（甲醇∶甲苯混合液（體積比為1∶1），KOH甲醇溶液（新鮮配制），水浴）。

2.2.2 EL提取法 該方法由 Schutter等[29]于2000年提出，也叫溫和堿性甲酯化法。具體步驟為：將15 mL的0.2 mol/L的KOH甲醇溶液和3 g的新鮮土樣加到35 mL的玻璃離心管中，混合均勻，在37℃下溫育1 h（脂肪酸釋放，并甲酯化，樣品10 min渦旋1次）。培養結束后，加入3 mL 1.0 mol/L的醋酸溶液中和pH值，充分搖勻。隨后加入10 mL正己烷，480 r/min離心10 min，使磷脂脂肪酸（PLFA）轉移到有機相中，將上層正己烷轉至干凈試管中，在氮氣流下吹干溶劑。將磷脂脂肪酸（PLFA）溶解在0.5 mL體積比為1∶1的正己烷∶甲基丁基醚溶液中。

2.2.3 MIDI提取法（MIDI Extraction Method）[29-30]

該方法操作簡單，提取的脂肪酸來自土壤微生物、土壤腐殖質和植物根系。該方法分4步進行：（1）皂化（NaOH 甲醇溶液，水?。?；（2）甲酯化（HCl∶甲醇（1∶0.85），水浴）；（3）提?。w積比為1∶1的正己烷∶甲基丁基醚溶液）；（4）洗滌（NaOH溶液）。與EL提取法相比，該方法多了洗滌步驟。

2.3 PLFA的鑒定方法

2.3.1 液相色譜質譜聯用（High Performance Liquid Chromatography-MassSpectrometry，HPLCMS）[22，31-33]HPLC-MS可分析完整磷脂種類（極性頭部）與脂肪酸側鏈（非極性尾部），能展示最初活體細胞膜磷脂分子所承載的全部信息。液質聯用的缺陷是一般沒有商品化的譜庫對比查詢，只能自己建庫或自己分析譜圖。目前，HPLC-MS在環境領域主要應用于有標準物質參照下的定性分析。該方法多用于食品方面，土壤方面應用較少。

2.3.2 Sherlock MIS4.5系統（Sherlock Microbial Identification System）[34-38]美國MIDI公司開發的基于細菌細胞脂肪酸成分鑒定的Sherlock MIS4.5系統，含有碳原子數在8～20（C8-C20）的116種脂肪酸譜圖庫。MIDI公司已經將PLFA技術商品化，常見的微生物PLFA譜圖基本上都包括在其數據庫內，儀器要求也由GC-MS降低為GC[39]。

2.3.3 氣相色譜質譜聯用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS）[9，40-43]GC-MS以氣相色譜作為進樣系統，質譜為檢測器，靈敏度較高，且可獲得更低的檢出限，分析效率也高，可同時做到定性與定量分析。不僅可識別那些不包括在MIDI系統中的脂肪酸，還可排除被MIDI系統錯誤識別的非酯成分；不僅可分析C8-C20的脂肪酸，并且可檢測到大于C30的脂肪酸。

目前，GC-MS和Sherlock MIS4.5系統在土壤微生物群落研究中被廣泛應用[44]。

3 PLFA方法的優缺點

與傳統的基于培養基的微生物分離技術及生理學、分析生物學方法相比，PLFA方法具有一定的優越性[44-47]，具體表現在：（1）不需要分離和培養技術，即可獲得微生物群落信息，適合微生物群落的動態追蹤；（2）減少分離和培養過程中的人為誤差，更為快速、簡便、精確；（3）試驗條件要求較低，結果較為客觀、可靠；（4）能定量描述環境樣品中的微生物群體；（5）最適合用作微生物群落的總體分析，而不是專一的微生物種類的研究。

雖然PLFA方法在分析土壤微生物群落結構方面有許多優勢，但也存在不足之處[22，48-50]：（1）因目前并沒有搞清楚土壤中所有微生物的特征脂肪酸，因此，土壤中存在的某些脂肪酸無法與土壤中特定的微生物對應；（2）不同種類微生物的特征脂肪酸有可能重疊；（3）該方法很大程度上依賴特征脂肪酸來表征微生物群落結構，故標記上的變動將導致群落估算上的誤差；（4）PLFA譜圖分析不能從菌種和菌株的水平精確描述環境中微生物的種類；（5）土壤中難免會有植物殘體存在，所以植物體內的磷脂脂肪酸可能會對土壤微生物群落的分析產生一定的干擾；（6）土樣保存條件不同，得到的PLFA分析結果也不同，因而在實際研究工作中受到一定限制；（7）PLFA方法不能分析古細菌。

4 結語

PLFA方法已廣泛應用于土壤微生物群落分析中，但其方法本身仍有改進之處，如分析結構特異性的PLFAs，以不斷完善特定脂肪酸數據庫，使PLFA方法更加精確等。隨著PLFA方法的不斷完善，其應用前景將會更加廣闊。

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