牛乳乳清蛋白過敏性研究進展

李 慧，劉小翠

（大同大學農學與生命科學學院，山西大同 037009）

食物過敏是世界各地普遍存在的一個嚴重問題。近年來，食物過敏的發病率逐年增加，食物過敏這一食源性疾病已引起廣大食品消費者、生產者和研究者普遍關注。Helm等[1]指出，有1%～2%的成年人和高達8%的嬰兒都產生過食物過敏。據報道，有8類食物經常引起過敏反應，占總過敏案例90%以上，它們分別為蛋、牛奶、魚類、甲殼類動物、花生、大豆、核果類食物及小麥[2]。研究表明，食物過敏輕者可引起皮膚、胃腸道過敏癥狀，重者可致哮喘發作、休克甚至死亡[3]。

牛奶是優質的營養食品，但同時也可能會產生過敏反應，其過敏原主要是牛奶蛋白質。牛奶中含有多種蛋白質，其中，乳清蛋白中的β-乳球蛋白是引起牛乳過敏的主要成分，其次為α-乳白蛋白，此外，牛血清白蛋白也能夠引起食物過敏[4-5]。牛奶過敏會影響蛋白質的正常消化吸收，嚴重影響嬰幼兒的健康成長。

1 乳清蛋白的組成

乳清蛋白（Whey protein）是牛奶中的一種主要蛋白質，其含量僅次于酪蛋白，占牛奶中蛋白質含量的18%～20%。乳清蛋白包括β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin，β-Lg）、α- 乳白蛋白（α-Lactalbumin，α-La）、血清白蛋白（BSA）、免疫球蛋白（IgG）、乳鐵蛋白、糖基肽及一些生長因子[6]。其中，β-Lg和α-La是乳清蛋白的主要成分。乳清蛋白中的組分基本為球狀蛋白質，其組分的一級結構、部分二級結構和三級結構已經研究清楚。

2 乳清蛋白的過敏性

2.1 α-乳白蛋白與食物過敏

α-La在所有哺乳動物乳中均存在，在牛乳清蛋白中的含量為19.7%，在人乳中含量較高。牛乳中的α-La是由123個氨基酸殘基組成的結構緊密的單體球蛋白。盡管牛的α-La與人乳中74%的氨基酸序列完全相同，6%的化學性質相同[7]，但是仍然被認為是牛奶中主要的過敏原[8]。α-La中的60-80，91-96片段通過二硫鍵連接形成環狀。動物試驗表明，這部分是最容易引起過敏的結構[9]。然而，用胰蛋白酶水解的α-La片段對19個過敏患者進行試驗表明，60-80，91-96這2部分肽段對于人免疫球蛋白E（IgE）并不是最主要的過敏原[10]。未改性的α-La和大量肽段容易與IgE結合，說明其具有重要的抗原決定部位構象。但對59-94部位的肽段降解后發現，其與IgE結合的能力比未改性的片段更高，這是由于抗原決定部位在蛋白質改性的過程中暴露而引起的[7]。此外，與IgE結合的部位主要位于α-La的疏水區域（如99-108）和分子內部（如17-58 和 109-123）。其中，17-58，109-123 片段與人的α-La有非常相似的序列，分別占α-La的 81%和 87%[11]。

2.2 β-乳球蛋白與食物過敏

β-Lg是牛乳清中的主要蛋白質，其單體是由162個氨基酸殘基折疊成的緊密球狀結構，約占乳清蛋白的43.6%，人乳中不含有。有資料表明，β-Lg是牛奶中最容易引起過敏的蛋白質。Hattori等[12]研究表明，乳蛋白過敏的人中有82%的人對 β-Lg過敏。Selo等[13]指出，β-Lg分子上分布有許多抗原決定部位。其中，一些是直鏈的氨基酸序列，而另一些引起免疫反應的結構是非常大的片段，可能包括抗原決定簇的構象或部分抗原決定簇。β-Lg中最容易引起過敏的片段是41-60，102-124和149-162的氨基酸序列，90%以上的病人都會對這些片段產生過敏，它們占到乳球蛋白與IgE總反應的10%～15%。149-162的碳端肽段形成彎狀結構，這部分主要包括一些短的α-螺旋結構，晶體結構很容易發生變化。而102-124及41-60的片段則在氫鍵和二硫鍵的作用下形成穩定的環狀，分布在分子表面，很容易和抗體結合[14]。此外，還有一些肽段也容易引起過敏，但其過敏性比上述肽段低。1-8，25-40及92-100的肽段會使52%～65%的病人血清產生過敏；40%患者的血清對9-14，84-91的肽段產生過敏反應；72-83，125-135的肽段會引起少數人過敏。值得注意的是，氨基酸序列124-134是β-Lg親水部位，位于分子表面且具有很強的免疫反應性[15]。Ball等[16]研究表明，84-91 的肽段并不在β-乳球蛋白分子的表面，但是仍有大約40%的人對其過敏。其他的2個肽段9-14及92-100沒有暴露在分子表面，而且不容易被酶解，因此，它們的免疫活性較小[13]。用溴化氫將8-24的肽段降解，發現9-14序列與IgE結合的特異性顯著降低，表明15-24是引起過敏的主要片段。用溴化氫將25-107的序列降解成小肽 25-40，41-60，78-83，84-91 和 91-100，發現66%的血清中并未降低其與IgE結合的能力。這表明在這段序列上至少有5個不同的抗原決定部位[7]。

3 乳清蛋白的改性

清除或降低乳中過敏原最有效的方法是將過敏原物質完全分離去除。將β-Lg去除后可以模擬人乳，并且這種方法可以用于生產嬰兒配方牛奶，但是這種方法費用很大，實際生產中很難實施[17]。因此，目前主要通過蛋白質改性的方法來控制和消除乳清蛋白中的過敏原。蛋白質的改性方法主要是利用物理因素（如熱、射線、機械振蕩等）、化學因素（如化學試劑等）或酶制劑使蛋白質的空間結構破壞，多肽鏈及氨基酸殘基發生某種變化。目前，常見的乳清蛋白改性方法主要有加熱處理、糖基化反應、發酵及酶解等。

3.1 加熱處理（Heat treatment）

加熱處理主要是使蛋白質的構象發生變化，蛋白質的結構展開，二硫鍵斷裂。對β-Lg加熱改性的研究表明，改性后的β-Lg在前腸黏膜的反應加強，從而改變了β-Lg的免疫學性質[18]。Kleber等[19]通過90℃熱處理β-Lg，證明了在熱處理β-Lg變性聚膠同時，β-Lg的抗原決定簇的活性被明顯掩蓋，從而使β-Lg的致敏性明顯降低，這種方法可以在一定程度上減少β-Lg的致敏性。但由于加熱過程中蛋白質與乳糖形成復雜的結構，將會增加賴氨酸的損失，降低蛋白質的營養價值[20]，而且加熱后使牛奶產生一定的蒸煮味，從而影響感觀特性。同時，對牛乳進行加熱處理也會使一些具有生物活性的免疫因子如免疫球蛋白等受到破壞。

3.2 糖基化改性（Glycosylation）

糖基化作用就是將碳水化合物以共價鍵與蛋白質分子上的α或ε-氨基相連接而形成糖基化蛋白的化學反應。研究表明，通過糖基化改性的β-Lg，其過敏性有效降低，而且提高了其熱穩定性和乳化特性。Makoto等[21]以葡聚糖、葡萄糖胺、殼戊糖和殼聚糖為糖基供體，通過美拉德反應對β-Lg的糖基化改性進行了研究，ELISA免疫試驗發現，以殼聚糖和葡聚糖為糖基供體的糖基化反應能明顯降低β-Lg的過敏性，而且糖基化的β-Lg乳化特性比原β-Lg有明顯提高。Tomomi等[22]通過將β-Lg與殼聚糖（Chitosan）按1∶1或1∶2的比例結合，經過分析可以在一定程度上降低β-Lg的致敏性，并且基本上保留了β-Lg的生物活性，其中，第2種比例比第1種效果好。但Leonil等[23]研究發現，糖基化的β-Lg的46-61的肽段是抗原決定部位。而且糖基化改性會影響蛋白質的營養價值甚至安全性[24]。糖基化會破壞必需氨基酸，尤其是造成賴氨酸的較大損失，而且小腸對改性蛋白的消化吸收降低也造成營養價值損失。關于糖基化蛋白的許多毒理學資料是以體外試驗為基礎，而體外試驗的資料與體內試驗影響相關性研究不多，因此，糖基化蛋白的安全性還不能得到證實[25]。

3.3 發酵（Fermentation）

Jedrychowski等[26]研究表明，牛奶經乳酸菌發酵后乳清蛋白的過敏性比原來降低了99%，但β-Lg和α-La的過敏性并沒有消除，只是減弱了。而且牛乳發酵后呈酸味，不宜加熱，嬰幼兒不容易接受。

3.4 酶解（Proteolysis）

蛋白酶催化乳清蛋白水解是降低過敏反應的一種有效方法。蛋白酶通過水解乳清蛋白的抗原決定部位，可以消除或降低其抗原性，降低牛乳過敏反應。不同的蛋白酶具有不同的特異性，因此，隨著所采用酶的不同及酶解條件的不同，酶解產物及抗原性的降低也有所不同。常用于乳清蛋白酶解的酶制劑主要有：胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶，此外還有關于Corolase、陰離子蛋白酶等酶解乳清蛋白的報道。隨著使用酶的種類不同，酶解位點、酶解率及酶解產物也有較大的差異。乳清蛋白由于具有二硫鍵，不易被消化酶即胃蛋白酶和胰蛋白酶水解，乳清蛋白的不易消化性是造成其容易引起過敏的原因[27]。

Ena等[4]研究表明，用胃蛋白酶和Corolase PP結合水解能夠徹底去除乳球蛋白和牛血清白蛋白的抗原決定部位，而用Corolase 7092酶解則幾乎對其抗原部位沒有影響。Penas等[28-30]通過酶水解與高壓相結合處理乳清蛋白溶液，以降低β-Lg的致敏性，試驗選用了4種酶（Alcalase，Neutrase，Corolase 7089 和 Corolase PN-L）并最終確定最佳結果的2種酶和相應條件（Corolase P N-L，40 ℃，15 min，300 MPa；Neutrase，50 ℃，15 min，300 MPa），通過 ELISA 檢測，試驗降低了β-Lg的大部分致敏性。Bonomi等[31]通過酶水解與高壓結合處理乳清蛋白溶液，試驗選用了菠蘿蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、胰島素和胰凝乳蛋白酶，最終確定胰島素和胰凝乳蛋白酶有較高的抗壓活性，可在合適的高壓處理下同時使用（600 MPa，10 min，pH 值為 6.8，酶解溫度為 30，37，44 ℃），對于β-Lg致敏性消除效果很好。對酶解產物分析發現，乳清蛋白的過敏性與酶解產物的分子質量有關。Van Berestijn等[32]研究表明，引起I型過敏反應片段的最小分子質量為3 000～5 000 Da。Ena等[4]報道指出，分子質量小于3 400 Da的肽段不會引發IgE介導的過敏反應。Van Hoeyveld等[33]指出，分子質量大于2 600 Da的肽段會引發皮膚的過敏反應，而小于1 400 Da的肽段則不會，體外試驗中能與IgE結合的最小分子質量范圍為970～1 400 Da。

4 結語與展望

乳清蛋白由于具有較高的營養價值及功能特性[34]，一直以來被廣泛的應用于食品工業。但乳清蛋白又是一種常見的過敏原，為了建立低過敏的水解模式，需要了解乳清蛋白的結構與免疫反應的關系、引起過敏的抗原決定部位的特點及其與IgE結合的部位。通過蛋白質改性的方法可以控制和消除乳清蛋白的過敏性，而且蛋白質改性能夠使其功能特性和營養價值也得到改善。

乳清蛋白的酶法改性是降低過敏反應最有效的方法，因此，酶水解將會是今后研究的重點。目前，針對乳清蛋白過敏患者，通過蛋白質改性的方法開發低過敏或無過敏的乳制品將會被更多的應用于商業生產中，具有廣闊的前景。

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