體外人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)鑒定及抗原表達分析

劉長樂，鄭心田，李廣平，孟恒星，邱錄貴

(1天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院，天津300211;2中國協(xié)和醫(yī)科大學血液病學研究所)

血管內(nèi)皮細胞(ECs)培養(yǎng)是體外研究人體大血管內(nèi)皮功能的重要手段。Jaffe等［1］首次從人臍靜脈中分離出ECs并在體外培養(yǎng)成功后，人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)作為體外研究ECs的模型受到心血管研究者的關注。2006年1～3月，本實驗應用改良的酶消化法進行HUVECs的體外培養(yǎng)、擴增和鑒定，并檢測其表面抗原表達，以用于ECs模型的構建。

1 材料與方法

1.1 材料 臍帶，DMEM/F12培養(yǎng)基，胎牛血清，hVEGF，鼠抗人:CD34IgG、VWF IgG、KDR IgG，羊抗鼠 IgG-FITC/PE，Dil-ac-LDL IgG，F(xiàn)ITC-UEA-1 IgG，DAPI。FACScar流式細胞儀，包被FN細胞培養(yǎng)瓶，倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡，恒溫培養(yǎng)箱，高速低溫離心機，細胞計數(shù)儀KX21型。

1.2 方法

1.2.1 HUVECs的原代培養(yǎng) 取健康產(chǎn)婦分娩后新鮮臍帶20cm，選擇無夾痕扭曲凝血阻塞的部分向臍靜脈注入0.1%膠原酶溶液至血管充盈，置入37℃無菌生理鹽水溶液15min后取出沖洗后合并于同一離心管內(nèi)離心。棄上清液加入20%胎牛血清的DMEM/F12(pH 7.0～7.2)重懸細胞，再用淋巴細胞分離液離心純化后接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。第2天棄培養(yǎng)液，換入新鮮含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)。每2 d半量換培養(yǎng)液1次，倒置相差顯微鏡觀察生長情況，蘇木—伊紅(HE)染色觀察攝片。

1.2.2 HUVECs的傳代培養(yǎng) 在培養(yǎng)第7天，觀察細胞長至融合狀態(tài)后，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS液沖洗25cm2培養(yǎng)瓶后加入2 ml 0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化，收集細胞—酶溶液，離心重懸細胞后按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 免疫熒光染色檢測 ①Ⅷ因子相關抗原檢測:細胞爬片后加入丙酮室溫固定，PBS液沖洗干燥后加鼠抗人Ⅷ因子單克隆抗體37℃濕盒反應1 h，PBS沖洗干燥后加FITC標記羊抗鼠IgG，37℃濕盒反應1 h，PBS沖洗干燥后用50%緩沖甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察攝片。②攝取乙酰化低密度脂蛋白(ac-LDL)及吸附荊豆凝集素1(UEA-1)檢測:細胞懸液在Dil標記ac-LDL培養(yǎng)液中孵育4 h，1%多聚甲醛固定，漂洗后與FITC標記UEA-1在37℃作用1 h，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 流式細胞儀檢測抗原表達 收集培養(yǎng)細胞用加疊氮鈉的PBS-PBA調細胞濃度至5×106個細胞，加入離心管，200 μl/管，含1 ×106個細胞。每管加20 μl FITC/PE標記鼠抗人單克隆抗體避光標記30min。細胞懸于 PBA 中檢測 CD31、CD34、KDR、VWF、CD133陽性表達百分比。

2 結果

2.1 倒置相差顯微鏡下細胞形態(tài) 直接觀察HUVECs于培養(yǎng)4～6 h開始貼壁，呈單層生長，互不重疊。形態(tài)由圓形逐漸鋪展呈多角形或短梭形。細胞邊界清楚，胞質豐富，胞核呈圓形或橢圓形，偶見雙核。長至6～7 d融合成片，呈鋪路石狀鑲嵌排列，傳代培養(yǎng)細胞生長旺盛。HE染色胞核呈藍色、卵圓形，位于中央，大而不規(guī)則，可見明顯的核仁，胞質均勻，胞質呈粉紅色，胞膜較清楚。

2.2 免疫熒光染色檢測 Ⅷ因子相關抗原免疫熒光檢測熒光顯微鏡下胞質中可見大量黃綠色熒光，以磷酸緩沖液替代鼠抗人Ⅷ因子抗體的陰性對照無此反應。攝取ac-LDL和吸附UEA-1的細胞功能檢測，Dil-ac-LDL紅色熒光，熒光強度高;FITC-UEA-1綠色熒光，熒光強度高;雙熒光陽性百分比＞80%;胞核呈藍色熒光。

2.3 表面抗原表達 CD31為 95.73%，KDR為99.66%，VWF 為 99.57%，CD34為 76.82%，CD133為3.48%。

3 討論

本實驗結果顯示，促增殖培養(yǎng)的HUVECs培養(yǎng)4～6 h呈單層貼壁生長，互不重疊。形態(tài)由圓形逐漸鋪展呈多角形或短梭形。細胞邊界清楚，胞質豐富，胞核呈圓形或橢圓形，偶見雙核。長至6～7 d融合成片，呈鋪路石狀鑲嵌排列，傳代培養(yǎng)細胞生長旺盛;通過HE染色細胞涂片相差顯微鏡下觀察:胞核呈藍色、卵圓形，位于中央，大而不規(guī)則，可見明顯的核仁，胞質均勻，胞質呈粉紅色，胞膜較清楚，說明HUVECs與 ECs的形態(tài)一致［1］。

本實驗應用Ⅷ因子單克隆抗體和FITC標記的二抗進行免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)細胞胞質內(nèi)有大量黃綠色熒光顆粒。ECs具有吸附ac-LDL的功能，血管炎癥反應時其特征性表現(xiàn)為內(nèi)吞ac-LDL增加［2］。UEA-1是鑒定ECs功能的特異性糖蛋白，其可以與具有內(nèi)皮系表型細胞胞膜上的L-巖藻糖特異結合［3］。本實驗顯示HUVECs能攝取ac-LDL，并且結合UEA-1，免疫熒光結果＞80%細胞呈雙陽性染色。

鑒定 ECs表型特征的常用標志包括 KDR、CD31、CD34、VWF［4］。此外，CD133是分子量為 120 kDa的糖基化多肽，具有造血干/祖細胞和內(nèi)皮前體細胞表型和功能特征，隨著細胞分化成熟CD133表達迅速下降，在分化成熟的ECs不表達。本實驗流式細胞儀檢測HUVECs(第7天)表面抗原表達:CD3195.73%，KDR 99.66%，VWF 99.57%，CD3476.82%，提示HUVECs表達ECs抗原陽性值極高，細胞純度高，相反CD133抗原的表達缺失，僅3.84%，說明幾乎沒有原始細胞和初步分化細胞，因為CD133抗原不被成熟ECs表達，也借此將原始干細胞與成熟分化細胞鑒別開來，此結果與Peichev等［5］報道一致。

［1］Jaffe EA，Nachman RL，Becker CG，et al.Cultureof human endothelial cells derived from umbilical veins.Identification by mor phologic and immunologic criteria［J］.J Clin Invest，1973，52(11):2745-2756.

［2］Ceriello A，dello Russo P，Amstad P，et al.High glucose induces antioxidant enzymes in human endothelial cells in culture.Evidence linking hyperglycemia and oxidative stress［J］.Diabetes，1996，45(4):471-477.

［3］Kaushal S，Amiel GE，Guleserian KJ，et al.Functional small-diameter neovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo［J］.Nat Med，2001，7(9):1035-1040.

［4］Blann AD，Taberner DA.A reliable marker of endothelial cell dysfunction，Does it exist［J］.Br J Haematol，1995，90(2):244-248.

［5］Peichev M，Naiyer AJ，Pereira D，et al.Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34(+)cells identifies a population of functional endothelial precursors［J］.Blood，2000，95(3):952-958.