高危型HPV病毒載量結合分型檢測在宮頸癌中的應用價值

張 蓉，侯文靜，喻 康，鄔美玉*

(1上海市奉賢區中心醫院，上海201400;2江蘇省常州婦幼保健院)

近年研究發現，約90%以上的宮頸癌組織中可檢測到人乳頭狀瘤病毒(HPV)DNA，其中高危型HPV約占60%［1］，高危型HPV感染與宮頸癌的發生密切相關。因此，國內外婦產科專家建議對30歲及以上婦女進行HPV DNA檢測及細胞學聯合的子宮頸篩查［2］，以盡早發現宮頸癌的發生。本研究對66例宮頸癌患者宮頸脫落細胞采用第二代雜交捕獲技術(HCⅡ)和HybriMax技術對HPV DNA進行病毒載量和分型檢測，以探討高危型HPV DNA與宮頸癌生物學行為的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2007年10月～2011年3月在常州婦保院及我院就診，經病理學診斷確診為宮頸癌患者66例，年齡23～63歲，其中鱗癌65例，腺癌1例;Ⅰ期38例，Ⅱ期28例;病理分級1級8例，2級55例，3級3例;33例已侵入宮頸間質。并對其中25例患者進行長期隨訪，術后復查高危型HPV DNA病毒載量和病毒分型。隨訪時間1個月～9 a。

1.2 儀器與試劑 HCⅡ基因雜交信號擴大儀(DML2000)及配套HPV DNA檢測試劑盒、宮頸細胞采樣器購自美國DIGENE公司，HybriMax醫用核酸分子快速雜交儀及配套HPV DNA檢測試劑盒購自香港凱普公司。

1.3 標本采集 采用配套宮頸采樣器插入患者陰道，與宮頸口順時針旋轉3～5圈，避免宮頸分泌物及血液污染，立即浸入含保護劑的專用試管，封蓋后送至實驗室4℃冰箱保存，2周內檢測。

1.4 HPV DNA病毒載量檢測 采用HCⅡ對患者宮頸脫落細胞HPV DNA載量進行檢測，共檢測16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68 等 13 種高危型HPV。由實驗技術人員嚴格按試劑盒說明書，經裂解—雜交—捕獲—信號放大—分析實驗步驟進行操作，在DML2000熒光檢測儀上讀取相對光學單位(RLU)。當 RLU/陽性對照 RLU＞1.0時表示HPV DNA陽性。

1.5 HPV DNA病毒分型檢測 采用HybriMax技術對患者宮頸脫落細胞HPV DNA進行分型檢測，檢測21種亞型，其中15種高危型為:16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68，還包括 6 種低危亞型:6、11、42、43、44 和 HPVcp8340。

1.6 統計學方法 應用SPSS13.0進行統計分析。采用χ2檢驗、秩和檢驗比較各組間差異。以P≤0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 高危型HPV DNA陽性率及病毒載量與宮頸癌生物學行為相關性 見表1。本研究宮頸癌患者高危型HPV DNA陽性率達94%(62/66)。宮頸癌患者各臨床分期、病理分級間高危型HPV感染率無明顯差異(P＞0.05)，但病毒DNA載量臨床分期Ⅱ期明顯低于Ⅰ期，病理分級2級、3級高于1級(P＜0.05)，且發生宮頸間質侵入的宮頸癌患者高危型HPV感染率及病毒DNA載量均上升(P＜0.05)。

表1 高危型HPV DNA陽性率及病毒載量與宮頸癌生物學行為相關性

2.2 高危型HPV DNA病毒分型與宮頸癌生物學行為相關性 見表2。本研究宮頸癌患者單一感染11例，多重感染55例，HPV16與HPV18有單一感染和多重感染兩種感染方式;而HPV33與HPV58則只見于多重感染。各臨床分期、病理分級及是否侵入間質中，多重感染率明顯高于單一感染率，并且多重感染率與臨床分期、病理分級、是否侵入宮頸間質有關(P ＜0.05)。

表2 高危型HPV DNA病毒分型與宮頸癌生物學行為相關性［例(%)］

2.3 術后隨訪 手術治療后隨訪宮頸癌患者25例，其中術前HPV DNA陽性24例(96%)，術后半年內陰性20例(80%)，術后10個月開始轉陰1例(4%)，持續陽性4例(16%)。術前病毒DNA載量中位數和四分位間距分別為46.31、147.34 pg/ml，術后分別為 0.50、1.23 pg/ml，手術前后有統計學差異(P＜0.05)。術前多重感染率76%(19/25)，術后6個月內為8%(2/25)，P ＜0.05。

3 討論

高危型HPV持續感染是宮頸癌及其癌前病變發生的必要條件［3，4］，這一觀點已得到國內外婦產科學者的共識。檢測高危型HPV DNA可從病因學水平篩選已發生或即將發生的宮頸癌病變。近年來，國內外婦產科醫師開始采用分子生物學技術進行高危型HPV DNA的篩查，HCⅡ是其中發展迅速的一種簡便可靠的技術。我們應用該技術對我院婦科疾病門診患者進行篩查，發現宮頸癌患者高危型HPV陽性率高達94%，與文獻報道的100%相比略低［5］，可能原因:①HCⅡ技術雜交探針僅包括13種高危亞型，某些其他高危型別未包括在內;②宮頸癌組織細胞缺氧造成的壞死有可能引起高危型HPV DNA的丟失;③婦科醫生宮頸取樣方法之間的差異有可能影響到樣本中宮頸脫落細胞數量，導致HCⅡ檢測結果受一定的影響。

高危亞型HPV的持續性或反復感染已被確定為宮頸癌發生的最主要原因，由于不同亞型HPV其編碼外殼蛋白的基因變異很大，不同亞型HPV之間基本上沒有交叉保護抗體，容易造成不同高危型HPV多重感染或者交叉感染。Lee等［6］研究發現，單一HPV感染使宮頸癌的患病風險增加19.9倍，而多重HPV感染使該風險增加到31.8倍。我們的研究表明，在宮頸癌臨床不同分期與病理不同分級中，多重感染率明顯高于單一感染率，并且與不同分期、分級、是否侵入宮頸間質有關，故對HPV DNA基因分型的檢測在宮頸癌的早期診斷和防治具有深遠的意義。

Meta分析顯示，高危型HPV檢測是最好的子宮頸錐切后CIN復發或持續存在的預測因子［7］。本研究隨訪發現，96%宮頸癌患者高危型HPV DNA陽性，80%術后半年轉為陰性，但4例患者術后持續陽性，目前隨訪資料顯示，4例術后治療效果良好，但他們是否有較高的復發率，仍在進一步的隨訪之中。

［1］Schiffman M，Castle PE，Jeronimo J，et al.Human papillomavirus and cervical cancer［J］.Lancet，2007，370(9590):890-907.

［2］Chen YY，You SL，Chen CA，et al.Effectiveness of national cervical cancer screening programme in Taiwan:12-year experiences［J］.Br J Cancer，2009，101(1):174-177.

［3］Castle PE，Rodríguez AC，Burk RD，et al.Long-term persistence of prevalently detected human papillomavirus infections in the absence of detectable cervical precancer and cancer［J］.J Infect Dis，2011，203(6):814-822.

［4］Schiffman M，Wentzensen N，Wacholder S，et al.Human papillomavirus testing in the prevention of cervical cancer［J］.J Natl Cancer Inst，2011，103(5):368-383.

［5］Saini R，Shen TH，Othman NH，et al.Evaluation of polymerase chain reaction(PCR)method and hybrid capture II(HCII)assay for the detection of human papillomavirus in cervical scrapings［J］.Med J Malaysia，2007，62(3):206-209.

［6］Lee SA，Kang D，Seo SS，et al.Multiple HPV infection in cervical cancer screened by HPV DNA chip ［J］.Cancer Lett，2003，198(2):187-192.

［7］Frega A，Biamonti A，Maranghi L，et al.Follow-up of high-grade squamous intra-epithelial lesions(H-SIls)in human immunodeficiency virus(HIV)-positive and human papillomavirus(HPV)-positive women.analysis of risk factors［J］.Anticancer Res，2006，26(4B):3167-3170.