PCR-SSCP技術研究現狀

張 利，黎曉敏

（西南大學動物科技學院，重慶 400715）

隨著分子生物學技術的發展，檢測基因結構和突變的方法不斷涌現，尤其是聚合酶鏈式反應（PCR）技術問世以后，各種與PCR相結合的基因檢測技術進一步推動了基因研究的發展。PCR是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復制。單鏈構象多態性分析技術（SSCP）是一種DNA單鏈疑膠電泳技術，是以構象為基礎檢測基因組中單核昔酸變異（是指基因組中單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性，包括單堿基的轉換、顛換、插入及缺失等形式）的方法。PCR-SSCP技術則是PCR技術和SSCP技術的結合，是現代遺傳學研究中用于檢測基因點突變和短序列缺失與插入的一種工具，其是利用不同構象單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中泳動速率的差異快速有效地檢測出DNA短片段中存在的單核苷酸突變，同時PCR-SSCP技術也被用于DNA定量分析，監測PCR診斷實驗中的交叉污染情況以及傳染源的調查等[1]。

1 PCR-SSCP技術的發展歷程

SSCP技術的建立，最早可以追溯到1984年，日本學者金澤等對獲得正常和F1-ATPase突變基因的大腸桿菌，酶切后進行電泳分析發現含點突變的DNA小片段在中性聚丙烯酰胺凝膠中的單鏈電泳遷移率與相應正常的DNA小片段的單鏈電泳遷移率明顯不同[2]。1989年，日本學者Orita等將此法用于檢測復雜基因組中單拷貝DNA中的多態現象，研究發現單鏈DNA片段呈復雜的空間折疊構象，當有堿基發生改變時，會或多或少的影響其空間構象，從而空間構象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受到的阻力不同而導致電泳速度不同[3]。隨后的研究中，Orita又將SSCP技術用于檢查PCR擴增產物的基因突變，從而使得分析變得更加靈敏，并且在原來的基礎上省去了酶切等步驟，進而改進了SSCP技術[4]。Ainsworth等成功地把銀染技術用于PCR-SSCP分析[5]。并且日本學者Hoshino等在1992年也將同位素標記法改為敏感的銀染法，增強了安全性，使得方法簡便、快捷[6]。此后，Maruya等建立了PCR-LIS-SSCP技術用于HLA分型，Iwahana等用MF-PCR-SSCP檢測人類K-ras突變，毛細管電泳技術與SSCP相結合用于同源和異源點突變的檢測等都是PCR-SSCP技術的改進和發展[7-8]。

SSCP技術值得注意的改進是將DNA-SSCP分析改為RNA-SSCP分析，原因是RNA有更多精細的二級構象，對單個堿基的突變很敏感，使得檢出率提高；而且RNA不易結合成雙鏈，可以較大量的進行電泳，有利于染色，只是該方法增加了一個反轉錄過程，需要一個較長的引物，內含有啟動RNA聚合酶的啟動序列，從而相對增加了難度。為了進一步提高檢出率，SSCP分析逐步發展為與其他突變檢測方法相結合，特別是與雜交雙鏈分析（Het）法結合大大的提高了檢出率，可以使點突變的檢出率接近100%。

2 PCR-SSCP技術的原理及操作過程

PCR-SSCP是一種簡單、有效、快捷、廉價的檢測少量基因組DNA或cDNA突變的技術，是近年發展起來的一種基因分析方法。其是以構象為基礎檢測基因組中單核昔酸變異（SNP），是繼第一代作圖用分子標記（RFLP）、第二代作圖分子標記（微衛星標記）之后的第三代作圖用分子標記方法之一，也是目前廣泛應用于分析分子種群生物學特征、遺傳性疾病檢測及特定功能基因或片段分型等的標記方法之一。該方法的基本原理是經PCR擴增的目的片段在變性劑或低離子濃度下經高溫處理使之解鏈并保證在單鏈狀態下，然后在一定濃度的非變性聚丙稀酰胺凝膠中電泳，單鏈DNA遷移率除與DNA濃度有關外，更主要取決于DNA單鏈所形成的空間構象即單鏈DNA的遷移率是序列依賴性的。相同長度的單鏈DNA，可以因其順序或單個堿基差異，所形成的空間構象就會不同，其在凝膠中泳動速度不一樣，從而顯示出帶型的差異即多態型[9-10]。

PCR-SSCP技術是PCR技術與SSCP技術的結合，其操作過程是PCR擴增靶DNA；將特異的PCR產物變性，而后迅速冰浴，使之成為具有一定空間結構的單鏈DNA分子；將適量的單鏈DNA進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結果。若發現單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發生改變，就可以判定該鏈構象發生改變，進而推斷該DNA片段中有堿基突變。

PCR-SSCP技術可以檢測任何（包括已知的和未知的）DNA位點上的多態性和突變，但適合于檢測小片段的DNA片段，片段長度要求＜500 bp，100～300 bp的片段最適合于PCR-SSCP分析，因為DNA過長，單鏈形成穩定的發夾結構的機會較少。當片段為200 bp時，單個堿基突變的檢出率高于90%，當片段為400 bp時，單個堿基突變的檢出率為80%以上，隨著DNA片段的長度加大，其檢出率逐漸降低[11]。

3 PCR-SSCP技術的研究現狀

PCR-SSCP技術作為一種分子生物學技術日漸得到發展和完善，如今在多個領域中得到廣泛應用，人醫上用于癌基因和抑癌基因突變的檢測、連鎖反應及基因作圖等，在獸醫臨床上也越來越多的應用該技術進行細菌種鑒定、細菌耐藥基因突變檢測、遺傳疾病基因突變分析等。

宋薇薇等通過分離肺結核患者痰中的DNA，采用PCR-SSCP分析檢測出絕大部分耐多藥結核病的耐藥基因，其中rpoB、katG、rpsL基因突變與結核桿菌對′RFP、INH、SM耐藥性有關，與傳統L-J藥敏實驗相比更敏感和快速，從而探討了PCR-SSCP技術作為新的藥敏方法在臨床上的應用價值[12]。鄭東鈞等應用PCR-SSCP結合RFLP技術檢測葡萄球菌的gyrA基因突變及norA基因，快速準確地檢測多種細菌gyrA基因中1個或多個堿基的差異[13]。這些都是將PCR-SSCP技術應用于基因突變檢測。

在細菌種快速、準確診斷中，楊文敏等應用PCR-SSCP技術對5種食源致病菌進行了16S rRNA的單鏈構象多態性分析，發現該方法有助于食物中毒致病菌的快速檢測[14]。蔡暢等應用該方法進行鴨疫里默氏菌（RA）16S rRNA基因的單鏈構象多態性分析，為其分類鑒定提供了分子指標[15]。

獸醫臨床上也將PCR-SSCP技術用于寄生蟲研究，主要是寄生蟲分類學研究、蟲種（株）的鑒定等方面。Li等以核糖體DNA第2內轉錄間隔區（1TS-2）作為遺傳標志，用PCR-SSCP分析成功鑒別了兩種不同的豬結節蟲第3期幼蟲[16]。Lin等以PCR-SSCP方法為基礎，通過描述體內的核糖體DNA轉錄區，描繪出了中國豬的結節線蟲屬性狀特征圖[17]。很多研究者也用該方法用于病毒的分型及變異，監測PCR實驗中的污染情況、病原體傳播途徑的研究。

PCR-SSCP技術也被廣泛應用于檢測引起各種遺傳病的基因突變，分析群體遺傳、基因分型等，揭示遺傳基因演化規律。李根銀等試驗表明，應用PCR-SSCP技術對5個豬種DECR1基因外顯子2單鏈構象多態性進行群體遺傳學分析，探討了豬種的群體遺傳平衡狀態即穩定性[18]。陳杰等應用該方法對豬的FSHβ亞基位點進行研究，發現其可以作為高繁殖力選擇的遺傳標記[19]。

4 小結

PCR-SSCP技術自建立以來，已廣泛用于分子生物學的各種領域，而且正在發揮著巨大的作用，特別是在遺傳性疾病基因突變分析、病原微生物鑒定中得到越來越多的應用，可以和DNA指紋技術、RFLPs技術相互結合在遺傳資源的調查中發揮作用，從而為利用遺傳資源提供理論依據。在不久的將來，PCR-SSCP技術在遺傳變異研究中將會得到更為廣泛的應用和發展。

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