豬細小病毒疫苗研究進展

孫海燕，葛 銘

（東北農業大學動物醫學學院，哈爾濱 150030）

豬細小病毒（PPV）能夠引起母豬繁殖障礙疾病，導致母豬產死胎、木乃伊胎、早期胚胎死亡和母豬不育等。德國學者Mayr在用豬腎原代細胞進行豬瘟病毒組織培養時首次發現了PPV，我國學者潘雪珠等于1983年分離到該病毒，目前該病已呈世界性分布，給養豬業造成了嚴重的經濟損失[1-4]。

PPV的感染尚無有效的治療方法，疫苗免疫預防仍是控制該病的主要手段。目前PPV疫苗主要包括滅活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亞單位疫苗、基因工程活病毒載體疫苗等，其中滅活疫苗具有安全性好、產生抗體時間長、不需要低溫保存的優點；弱毒疫苗免疫效力較強、產生抗體快、用量少、成本低，但安全性較差；基因工程亞單位疫苗免疫源性較好，但成本和技術要求都比較高；基因工程活病毒載體疫苗可以同時預防兩種病或多種病的、能夠誘導較強的免疫反應，但生產技術復雜、成本較高；基因疫苗生產工藝簡單、免疫劑量小、成本低廉、可構建多基因或多價疫苗，但其安全性受到廣泛關注[5-7]。

1 弱毒疫苗

弱毒疫苗又稱活疫苗，經人工致弱而失去對原宿主的致病力，但仍保持良好的免疫原性的病原體，或用自然弱毒病原體制成的疫苗。弱毒疫苗免疫力較強，產生抗體快，用量少，成本低，但存在毒力返強及散毒的可能，并需要低溫貯運。目前的弱毒疫苗主要有NADL-2、HT株、HT-SK-C株和N株，這些弱毒疫苗主要在國外應用。最早應用于臨床的是NADL-2弱毒株，該毒株是豬細小病毒強毒株在細胞上連續傳50代以上致弱的。該毒株的VP2基因比強毒株NADL-8少300 bp。日本學者Fujisakl等將豬細小病毒野毒株在豬腎細胞上低溫30℃連續傳54代，產生了HT變異株，該毒株接種豬后能誘導產生高滴度的抗體和較強的免疫力，并且不產生病毒血癥，但能誘導產生高滴度的抗體和較強的免疫力[8]。杜堅等對分離到的一株豬細小病毒自然弱毒株進行免疫接種試驗證實，該弱毒株具有良好的免疫原性和保護力，并且不產生病毒血癥[9]。盡管已有多株弱毒疫苗在臨床上應用，但是由于PPV強毒株的大量存在，人們對病毒重組及弱毒返強的擔心一直使弱毒疫苗的應用受到一定限制。

2 滅活疫苗

我國均普遍使用豬細小病毒滅活疫苗，使用的主要滅活劑有福爾馬林、β-丙內酯（β-PL）、N-乙酰乙烯亞胺（AEI）、二乙烯亞胺（BEI）等。有試驗表明，豬細小病毒用福爾馬林滅活后制成疫苗的保護效果不如用N-乙酰乙烯亞胺滅活后制成疫苗的保護效果好；用β-丙內酯滅活疫苗的保護力較好。免疫佐劑也是影響豬細小病毒滅活疫苗免疫效果的重要因素，但幾種佐劑的混合物，如油佐劑、SDS、L-121、氫氧化鋁和油乳劑的混合物以及SDS、氫氧化鋁的混合物作佐劑的疫苗產生的抗體滴度均較低。目前經常采用的佐劑是蜂膠、氫氧化鋁和油水乳劑[10]。豬細小病毒滅活多聯疫苗的使用較為廣泛，主要有豬細小病毒-豬偽狂犬病病毒、豬細小病毒-乙腦病毒等二聯苗，因為除了豬細小病毒外，豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸綜合征障礙病毒（PRRSV）、乙腦病毒（JEV）等均能引起母豬的繁殖障礙，而且多聯苗的使用可以簡化免疫程序，降低臨床應激反應，適合規模化養豬。

3 基因工程疫苗

基因工程疫苗是將編碼病毒的某種特定蛋白質的基因與適當質粒或病毒載體重組后導入受體（細菌、酵母或動物細胞），使其在受體中高效表達，提取所表達的特定多肽，加入佐劑制成的一種新型疫苗。其免疫原性較好，但技術要求高，成本昂貴，難以在臨床上推廣應用。盡管豬細小病毒的弱毒苗和滅活苗在豬細小病毒的防治中發揮了十分重要的作用，但是其均存在不同程度的缺陷和不足，如弱毒疫苗存在重組和毒力返強的潛在威脅，而滅活苗的免疫效果不穩定。因此，研制更為安全有效的疫苗成為豬細小病毒免疫防制的主題。

4 基因工程亞單位疫苗

基因工程活病毒載體疫苗是利用基因操作技術，將異原性病毒的保護性抗原基因及啟動子序列插入到作為載體的另一種病毒（如弱毒疫苗株）的基因組非必需區中，由于異原病毒基因已成為載體病毒基因組的一部分，可隨載體病毒的繁殖而不停的表達，因而這種疫苗在機體可同時誘導產生針對載體病毒及異原性病毒的特異性免疫反應[11]。活病毒載體疫苗與弱毒疫苗相似，能誘導強而持久的免疫反應，而且作為載體的活病毒經過改造其安全性較傳統弱毒疫苗大為提高。但其生產技術復雜，成本較高，目前仍多處于實驗室研究階段。

吳丹將豬細小病毒VP2基因及豬γ-干擾素（IFN-γ）基因同時克隆到真核表達載體中，構建了共同表達VP2和IFN-γ的基因免疫質粒，用此表達質粒單獨或加入脂質體肌注接種小鼠，結果表明，脂質體可以加強表達質粒接種小鼠的免疫應答水平，為研制豬細小病毒基因疫苗提供了依據[12]。呂建強等將豬細小病毒的VP2基因插入到豬偽狂犬病病毒載體中，有望研制出豬細小病毒-豬偽狂犬病病毒二聯重組基因工程苗[13]。

5 核酸疫苗

核酸疫苗又稱基因疫苗，包括DNA疫苗和RNA疫苗兩種，目前研究中以DNA疫苗為主。核酸疫苗是含有編碼蛋白基因序列的質粒載體，將質粒經一定途徑導入宿主體內，并在宿主細胞中表達抗原蛋白，從而誘導宿主產生相應免疫應答，達到預防疾病的目的。DNA疫苗在預防和治療感染性疾病、變態反應和癌癥等方面有著廣泛的應用前景[14]。

與傳統疫苗相比較，核酸疫苗免疫效果更好，DNA疫苗接種機體后，蛋白抗原是在宿主細胞內表達，其加工遞呈過程都與病毒自然感染十分相似，從而激發較強的免疫應答，DNA疫苗既可以誘導體液免疫又可誘導強烈的細胞免疫，導入宿主體內的DNA載體不會受到母源抗體的影響，在許多動物疾病早期預防中意義重大；產生的免疫應答持久，導入的外源基因可以在宿主體內存在較長的時間，不斷地表達蛋白抗原，能夠持續地給機體免疫系統提供刺激，因此能夠使機體產生持久的免疫應答；DNA疫苗可以通過質粒攜帶兩個或多個抗原基因，從而構建多價疫苗或多聯疫苗，大大提高疫苗的效果或達到接種一種疫苗預防多種疾病的目的；DNA疫苗不會出現弱毒疫苗和活載體疫苗的毒力返祖的危險；生產簡單、運輸方便，DNA疫苗只需構建高效表達的質粒，在細菌中生產，可在短時間內大量擴增并純化，省去了傳統疫苗的蛋白表達提純等繁瑣工作，干燥DNA疫苗在室溫穩定性高，不需要冷藏設備，大大降低了儲存和運輸的成本。趙俊龍等用豬細小病毒的VP1和VP2基因分別構建了豬細小病毒的核酸疫苗，結果表明，這兩種疫苗均能誘導產生較高水平的體液免疫和細胞免疫[15]。

DNA疫苗構建過程中目的基因的選定是決定疫苗免疫效果的關鍵，應選擇病原主要的保護性抗原基因或將同一病原的多種保護性抗原基因同時克隆入載體中，另外，選擇安全高效的表達載體質粒。不同的免疫途徑對DNA疫苗的免疫效果也有一定的影響，目前采用的主要免疫途徑為肌肉注射。對接種的組織進行預處理可提高外源基因表達量，增強免疫效果。研究發現，許多細胞因子的基因插入到疫苗DNA質粒中作為遺傳佐劑，可以提高機體的免疫應答水平（例如干擾素基因、轉移因子基因、IL-2等）[16]。DNA疫苗的安全性是被廣為關注的問題，人們擔心外源基因會整合到宿主的染色體上而導致細胞癌變。但迄今為止，研究者們還沒有發現這樣的整合性。理論上應用病毒DNA疫苗的轉化作用和轉化機率不會高于病毒的自然感染。由于DNA疫苗在體內引起的免疫反應較慢，不適于作為某些病毒的緊急接種。如何提高DNA疫苗的導入效率，也需要進行深入的研究[17-18]。

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