仙鶴草水提物急性毒性和遺傳毒性實驗研究

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(1.海門市悅來醫院,江蘇 海門 226131；2.南通大學，江蘇 南通 226007)

仙鶴草為薔薇科多年生草本植物龍牙草(AgrimoniapilosaLedeb)的全草,又名脫力草、龍牙草、黃龍尾、狼牙草等，在我國大部分地區均有分布，全草含仙鶴草素、仙鶴草、內酯、鞣質、有機酸、酚性成分、皂甙等化學成分。現代藥理研究[1]表明仙鶴草及其提取物具有抗腫瘤、抗炎鎮痛、降血糖、降血壓、增強機體免疫功能等作用，臨床上主要用于止血、抗腫瘤，泌尿、呼吸、消化系統等疾病及婦科病的治療。但有關仙鶴草急性毒性和遺傳毒性的報道甚少。根據有關規定本研究對仙鶴草水提物進行了急性毒性和微核實驗評價研究[2]。采用不同的實驗指標,了解仙鶴草水提物的急性毒性及可能的中毒癥狀，測定其最大耐受量，為其在臨床上的安全應用提供可靠的科學依據及安全性評價。

1 實驗材料

1.1 藥品 仙鶴草水提物：稱取干燥仙鶴草(購于中藥店)100 g,加入10倍體積的水，加熱提取2次,每次2 h，合并提取液，濃縮為80 mL，生藥含量1.25 g/mL。高速冷凍離心，用直徑為0.22 μm的微孔濾膜正壓過濾除菌。制備成1～2 g/mL水提液(水煮醇沉、過濾濃縮)備用。灌胃體積為0.4 mL/20 g。

1.2 實驗動物 健康成年ICR小鼠,由南通大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK(蘇)2006-0019。體質量18～22 g，雌雄各半，禁食10 h后進行實驗。實驗溫度(24±1)℃，相對濕度60%。實驗前至少馴養觀察1周，記錄動物的行為活動、飲食、體質量及精神狀況。

1.3 實驗試劑 1)注射用環磷酰胺(CY)：批號，900421，上海第十二制藥廠生產。2)小牛血清：濾菌后放入56 ℃恒溫水浴保溫1 h進行滅活，4 ℃儲存。亦可用大、小鼠血清代替。3)Giemsa原液：稱取Giemsa染料3.8 g，加入375 mL甲醇(分析純)研磨，待完全溶解后，加甘油125 mL，37 ℃恒溫箱保溫48 h，振搖數次，過濾，2周后可使用。4)磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)：KH2PO44.50 g，Na2HPO4·12H2O 11.81 g，蒸餾水至1 000 mL。

2 方法與結果

2.1 急性毒性實驗[3]預試驗：小鼠30只，隨機分為3組，每組10只，以不同劑量的仙鶴草水提物灌胃，其中組1用量為20 g/kg；組2用量40 g/kg；組3用量80 g/kg。灌胃前動物禁食過夜，自由飲水。灌胃后給予正常飲食，觀察中毒癥狀、死亡情況，觀察24 h,未見小鼠出現任何中毒反應(觀察記錄的內容包括皮膚、黏膜、毛色、眼睛、呼吸、循環、自主及中樞神經系統行為表現等)。

最大耐受量測定：小鼠30只，以80 g/kg仙鶴草水提物灌胃，連續觀察7 d，未發現小鼠有任何中毒癥狀，在觀察期內所有小鼠均存活。

結論：小鼠灌胃給予仙鶴草水提物浸膏的最大耐受量>80 g/kg。2周內無動物死亡，亦無明顯的中毒表現或不良反應。即仙鶴草對雄、雌性ICR種小鼠的急性毒性LD50均>80 g/kg，屬無毒物。

2.2 微核試驗[4]取體質量18～20 g ICR小鼠50只，分為5個試驗組,每組10只，雌雄各半。試驗組分別為空白組生理鹽水，陽性對照組環磷酰胺，仙鶴草高劑量組80 g/kg,仙鶴草中劑量組40 g/kg，仙鶴草低劑量組20 g/kg。陽性對照組用環磷酰胺生理鹽水溶液1次腹腔注射50 mg/kg。2次接毒，間隔24 h。

制片：在第2次給予受試物6 h時將小鼠脫頸椎處死。取下小鼠兩側股骨，剔去肌肉，用濾紙或紗布擦去血污和肌肉碎片，剪去兩端骨骺(小鼠股骨較短、細，剪股骨頭時,應盡量保持股骨中段的完整)后，用配有6號針頭的l mL注射器吸取小牛血清約0.05 mL，從股骨上端開口處沖洗骨髓腔數次，將沖洗物從股骨下端開口處滴到載玻片上。

推片：以同一注射器吸取載玻片上的沖洗物，然后推出，如此重復數次，使之調勻后，推片若干張迅速干燥。

固定：將干燥的涂片置甲醇液中固定5～10 min，取出晾干。

染色：固定好的涂片用Gimsa染色l5～30 min。用純化水沖洗,干燥，待檢。染液濃度、pH、染色時間等多種因素可影響染色效果，例如微核可被染成鮮紅色、藍紫色或紫紅色，甚至同一張標本上也會出現染色深淺不一致的現象,因此計數前時必須仔細觀察PCE和成熟紅細胞的差別,正確辨認。每只小白鼠計數1 000個嗜多染紅細胞中具有微核的細胞數，微核率用‰表示。

先在低倍鏡下選擇細胞分散均勻、形態完整、染色良好的區域，再轉到油鏡下，觀察嗜多染紅細胞的微核。典型的微核多為單個、圓形、邊緣光滑整齊，偶爾呈腎形、馬蹄形或環形,嗜色性與主核一致，直徑通常為紅細胞的1/20～1/5。每張玻片標本計數100～200個嗜多染紅細胞，按“‰”計算微核的出現率，微核計數以“細胞”為單位，即1個細胞中出現2個或2個以上微核時，只按“1”計算。

結果：各劑量組不同性別動物骨髓嗜多染紅細胞微核細胞率與陰性對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。陽性對照組與陰性對照組相比較，差異有統計學意義(P<0.01),表明受試物在最高劑量80 g/kg下，未見有誘發小鼠骨髓微核細胞率增高作用，見表1。

表1 仙鶴草對小鼠骨髓細胞微核發生率的影響

3 討論

仙鶴草首載于《本草圖經》，主要功能在于收斂止血。近人李鐘文氏則認為仙鶴草很多重要功能都已失傳，經其從本草古圖譜、藥用部位、植物形態等多方面考證，認為現在“處處有之”的仙鶴草，就是古人治療險惡之癥的牙子。其名稱演變過程為牙子一狼牙一狼牙草一龍牙草一龍芽草一仙鶴草[5]。在《神農本草經》中仙鶴草被歸于“多毒不可久服的下品藥，載：“牙子味苦寒，主邪氣熱氣，疥瘙惡瘍瘡痔，去白蟲。”《名醫別錄》稱其有毒。李時珍亦從“有毒”之說，將其置于毒草類[6]。而現代藥理研究[7]也證明，仙鶴草的有效成分鶴草酚有毒，毒性主要表現在胃腸道及神經系統反應，應用較大劑量可使家犬雙目失明，病理觀察也證明了上述損害。文獻報道[8]過量服用仙鶴草致腎功能衰竭。此外臨床上仙鶴草不良反應主要有失明、呼吸困難、皮疹、頭昏、面紅、惡心嘔吐、甚至引起過敏性休克。在大劑量應用仙鶴草時應權衡利弊,每劑高達500 g的劑量應盡量避免。

仙鶴草是否無毒以及能否毫無顧忌地大劑量使用，事關臨床用藥的安全性。近年來，許多中藥毒理學研究表明，某些中草藥及其所含的某些化學成分具有特殊毒副作用，故對中草藥的毒理研究應予高度重視。特別在遺傳毒性研究中，微核試驗是目前國內外廣泛用于檢測染色體損傷的一種快速、經濟、簡便的致突變篩選試驗[9]。本文的目的就在于闡明仙鶴草水提物安全性，對仙鶴草進行實驗的結果顯示：仙鶴草無明顯急性毒性反應，無遺傳毒性，是一種安全無毒的中藥，可開發成中藥新藥，挖掘其臨床應用價值，為廣大患者造福。

[1]金在久.仙鶴草的化學成分及臨床研究進展[J].華西藥學雜志,2006,21(5):468-471.

[2]中華人民共和國衛生部藥政局.新藥(西藥)臨床研究指導原則匯編(藥學·藥理學·毒理學)[M].北京:科學技術出版社,1993:203-204.

[3]李儀奎,王欽茂,陳奇,等.中藥藥理實驗方法學[M].上海:上海科學技術出版社,1991:299-305.

[4]徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學[M].北京:人民衛生出版社,1985:508.

[5]宋·唐慎微.重修政和經史證類備用本草[M].北京:人民衛生出版社,1957:258.

[6]明·李時珍.本草綱目(校點本)[M]北京:人民衛生出版社,1982:11.

[7]范尚坦,李金蘭,左暉.仙鶴草的不良反應[J].福建中醫藥,2002,33(1):47-48.

[8]賴中福,盧壬丹.過量服用木通、仙鶴草致腎功能衰竭各1例[J].中國藥業,2003,12(7):59.

[9]中華人民共和國藥典委員會.中國藥典[S].北京:化學工業出版社,2005:88.